用于毛蕊異黃酮痕量分析的電化學傳感器研究

孫伯祿 蔡金穎 李玳 茍曉丹 茍于強 李文 胡芳弟

摘?要?通過簡單的熱解過程成功制備了結構優化的多孔石墨烯（PG），并用于構建復雜體系中毛蕊異黃酮（CYS）痕量分析的電化學傳感器。采用拉曼光譜法、傅里葉紅外光譜分析法及掃描電子顯微鏡對制備過程進行了表征。循環伏安法（CV）和交流阻抗法（EIS）研究了PG修飾的玻碳電極（PG@GCE）的電化學行為，結果表明，PG有效增加了修飾電極的有效比表面積和電極表面的電子傳遞速率，中藥電活性成分CYS在PG@GCE表面具有良好的電化學響應。在優化的條件下，采用差分脈沖伏安法（DPV）對CYS進行分析，CYS在1.8×107～4.4×105 mol/L濃度范圍內具有良好的線性關系，檢出限為5.8×10一種新穎的分析手段，也進一步深化了PG在藥物分析領域的應用。

關鍵詞?多孔石墨烯; 毛蕊異黃酮; 電化學傳感器; 痕量分析

1?引 言

毛蕊異黃酮（Calycosin， CYS）作為中國藥典規定的用于中藥材黃芪和紅芪質量標準評價的指標性成分之一，在機體內常與細胞膜上的ER受體結合，能夠有效調節MAPK信號通路[1]，在腫瘤的防治[2]、炎癥的消退[3]、糖尿病認知障礙[4]和心血管疾病的改善[5]等方面具有重要作用。藥材和制劑中以及機體內最低血藥濃度時，CYS含量的快速、實時、準確的分析，對于以CYS為評價指標的藥材、制劑的質量控制和CYS發揮藥效防治相關疾病具有極為重要的意義。

CYS作為典型的異黃酮類化合物，是以3-苯基苯并吡喃酮為母核，7，3′位連接羥基（OH），4′位連接甲氧基（OCH3）而成。由于連接在3位的B環與C2C3雙鍵、4位羰基及A環形成了p-π共軛體系，有利于電子離域，致使3′位羥基（OH）具有較高的活性[6]，極容易發生氧化還原反應。因此，可以通過電化學方法檢測3′位羥基發生氧化還原反應的電信號，進而實現樣品中CYS含量的快速分析。然而，目前CYS的分析方法多采用色譜法[7～9]和色譜-質譜聯用[10，11]等技術，這些方法多需復雜的樣品前處理和繁瑣耗時的操作，不便于復雜樣品中CYS的便捷高效分析。電化學分析技術因其具有無需復雜的樣品前處理、操作簡便、靈敏度高、分析速度快等特點[12～14]，已在水質監測、食品安全、藥品質量評價等領域受到研究者的關注[15～18]。目前鮮有采用電化學方法用于CYS分析的報道。

多孔石墨烯（Porous graphene， PG）為具有中空網絡結構的石墨烯衍生物，既保留了單層石墨烯優良的導電性能，又克服了石墨烯自身過強的π-π堆疊而導致的堆積和自聚集的缺點[19，20]，其顯著增大的比表面積能夠使待測物最大程度暴露，而連續和互連的石墨烯孔隙則有利于電荷載體的迅速移動[20，21]，有利于改善和提高傳感器性能 [22～24]。Yang等[25]制備了一種空心結構的CuCO2O4多面體/PG復合物，構建了用于葡萄糖靈敏測定的電化學傳感器，結果表明，葡萄糖在0.5～3354 μmol/L范圍內具有良好的線性關系，檢出限為0.5 μmol/L（S/N=3）。Dong等[26]采用化學氣相沉積的方法將PG附著在Ni表面，構建了用于多巴胺分析的電化學傳感器，該方法具有較低的檢出限（25 nmol/L）和較高的靈敏度，且可以很好地區分尿酸的干擾。

目前，尚未有以PG為電極修飾材料構建的用于復雜體系中中藥電活性成分靈敏分析的研究報道。基于此，本研究制備了PG，以其為電極修飾材料，構建了用于CYS痕量分析的電化學傳感器。結果表明，此傳感器用于中藥提取物和血漿樣品中CYS分析時，呈現出較低的檢出限、較寬的線性范圍及較好的選擇性。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

CHI 6041E型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）， 采用三電極系統：以修飾玻碳電極（GCE， d=3 mm）為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑絲電極為輔助電極; JSM-6701F冷場發射型掃描電鏡（日本電子光學公司）; Finder One 微區激光拉曼光譜儀（北京卓立漢光儀器有限公司）; Nicolet IS5紅外光譜儀（美國Thermo公司）。毛蕊異黃酮（CYS， 寶雞市辰光生物科技有限公司）。所用試劑均為分析純。

2.2?實驗方法

2.2.1?PG的制備?采用熱解法制備PG[27]：首先將2 g金屬鈉（Na）和5 mL乙醇（C2H5OH）以摩爾比1∶1混合，在不銹鋼反應器（50 mL）中220℃加熱48 h， 冷卻至室溫，得到白色產物。將得到的白色產物用去離子水裂解，白色產物變成黑色，即為PG。用去離子水反復洗滌數次，最后將其冷凍干燥，獲得最終產物PG，用異丙醇溶解，配制成1 mg/mL的分散液，備用。

2.2.2?修飾電極的制備?將玻碳電極用0.3 μm和0.05 μm的氧化鋁粉依次打磨拋光，蒸餾水沖洗，隨后將處理后的電極依次于甲醇和蒸餾水中超聲清洗1 min，自然晾干，備用。采用滴涂法將5 μL 1 mg/mL的PG分散液修飾在玻碳電極表面，自然晾干，記為PG@GCE。

2.2.3?電化學表征?在含有5 mmol/L [Fe（CN）6]3/4和0.1 mol/L KCl 溶液中，用循環伏安法（Cyclic voltammetric， CV）和交流阻抗法（Elecctrochemical impedance spectroscopy， EIS）對不同修飾電極進行表征。CV的測量條件為：電位范圍為0.2～0.8 V，掃速為100 mV/s。EIS測量條件為：振幅為0.005 V，電壓為0.2 V，頻率范圍為101～105 Hz。

2.2.4 樣品的制備?（1）黃芪、紅芪樣品溶液的預處理?稱取4 g黃芪粉末（過4號篩），置于250 mL圓底燒瓶中，加入40 mL甲醇，于80℃水浴回流提取兩次，每次1 h，過濾，合并兩次提取液并濃縮至10 mL。 待測紅芪樣品溶液處理方法同上。（2）生物樣品溶液的預處理?小鼠動脈取血4 mL于肝素抗凝管中，4℃下放置，備用。取2 mL 0.204 mg/mL CYS甲醇溶液于EP管中，加入抗凝血漿2 mL，振搖混合，將混合液于4000 r/min離心15 min，取上清液，即得樣品溶液，待測。

3?結果與討論

3.1?材料的表征

修飾在電極表面的氧化石墨烯（Graphene oxide， GO）堆疊形成一種相互交錯的褶皺結構。修飾在電極表面的PG的整體形貌，倍數放大的內部呈現中空網絡結構的PG形貌，大量的孔道作為PG結構的支撐[28]，有效地防止了石墨烯納米片層聚集，大大增加了PG的比表面積，也為小分子電活性化合物的富集、生物分子的吸附等提供了較多的活性位點。此外，PG中空的網絡結構為電荷載體在其連續和互連的孔徑中的迅速移動提供了可能，有利于電化學傳感器靈敏度的提高 [27]。

采用紅外光譜對GO和PG進行了表征。PG（曲線b）在3000～3700 cm1處的紅外吸收較GO（a）明顯減小，這是由于PG表面所帶的含氧官能團較少所致。此外，GO在1400和1048 cm1處分別對應OH鍵和CO鍵的特征吸收[29]，而PG在此處的特征吸收峰則明顯減弱，甚至消失，表明本研究所制備的PG具有較低的氧化程度。

由拉曼光譜可見，GO（曲線a）和PG（曲線b）在1346和1580 cm1處有兩個明顯的峰，分別對應D帶和G帶。G帶為E2g光學模式的一階拉曼散射，對應于有序的sp2結構; D帶為布里淵區K點的A1g聲子模式，對應于無序程度和邊緣的局部缺陷，D峰與G峰的強度比（r=ID/IG）可用于衡量物質的缺陷和混亂程度，D帶是由sp2雜化轉變為sp3引起的，這一變化會影響有序性[30]。通過計算可得GO 和PG 的D峰與G峰的強度比rGO=0.780， rPG=1.05，可知本研究制備的PG具有相對較多的缺陷結構，這與PG具有的中空網絡結構密切相關，此結果與SEM表征結果相一致。

3.2?電化學傳感器有效比表面積的計算

以K3[Fe（CN）6]為探針分子，采用計時庫侖法對3種電極（GCE、GO/GCE和PG@GCE）的電化學有效表面積進行了計算，計時庫侖法的電化學實驗參數設置為：起始電位0.5 V，終止電位0.2 V，脈沖寬度 0.25 s，采樣間隔2.5×104 s。根據Anson方程[31]：

式中，c表示電解液中底物的濃度，D為擴散系數（0.5 mmol/L K3[Fe（CN）6]在1.0 mol/L KCl 溶液中的擴散系數為1.39×104 cm2/s），n為電子轉移數，Qdl為雙電層電量，Qads為感應電荷，A為電極的電化學有效表面積，F為法拉第常數。Q與t1/2呈良好的線性關系，根據線性方程的斜率可以計算出GCE、GO/GCE和PG@GCE的電化學有效表面積分別為0.16、0.23和0.47 cm2。結果表明，玻碳電極經PG修飾后，電化學有效面積顯著增加，有利于CYS在電極表面的大量富集，進而增強了CYS的電化學響應信號。

3.3?PG@GCE修飾電極的電化學表征

采用循環伏安法和交流阻抗法對基于PG構建的電化學傳感器進行了表征。當PG修飾在玻碳電極表面（曲線b）后，峰電流明顯較裸玻碳電極（曲線a）增大，這是由于PG中空的網絡結構和優良的導電性，增加了電極表面電子的轉移速率。交流阻抗法的表征結果進一步表明，PG修飾在裸玻碳電極（曲線b）表面后，極大地減小了電子傳遞電阻（Ret），有效促進了電極表面電子的快速轉移。

3.4?CYS在傳感器上的電化學行為

考察了0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（ABS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、檸檬酸鹽緩沖液（CPBS）為支持電解液中傳感器的電化學響應。實驗結果表明，構建的傳感器在0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液中的基線平穩且響應最靈敏。因此，選擇醋酸鹽緩沖液作為支持電解液。GCE（曲線a， b）和PG@GCE（曲線c， d）在不含有和含有2.8×105 mol/L CYS的0.1 mol/L pH 7.0的醋酸緩沖液中的循環伏安圖。PG@GCE在空白緩沖體系中沒有氧化還原峰。CYS在GCE（曲線b）上出現一對較弱的氧化還原峰，而在PG@GCE上呈現一對明顯的接近對稱的氧化還原峰，峰電位分別為Epa=0.230 V和Epc=0.412 V，Ep=182 mV，表明CYS在PG@GCE上具有良好的電化學響應，明顯增強的伏安響應是由于PG大的比表面積和可顯著促進電極表面電子快速傳遞的性質。

3.5?實驗條件的優化

3.5.1?修飾量的影響??電極表面PG的修飾量對CYS的氧化峰電流具有很大的影響。修飾到電極表面的PG量較少時，膜較薄， CYS在電極表面的富集量不足; 修飾過量又會導致電子傳遞路徑增加，電極靈敏度下降，電化學響應減小。顯示了修飾量對CYS氧化峰電流的影響，當用5 μL 1 mg/mL PG的異丙醇溶液進行修飾時，所得電極的氧化峰電流最大，因此選擇5 μL為最佳修飾量。

3.5.2?pH值的影響?采用循環伏安法在pH 3.0～8.0范圍內研究了緩沖液pH值對CYS電化學行為的影響。氧化還原峰電位隨著pH值的升高而負移，表明此電極反應有質子參與;Epa 與pH值的線性方程： Epa（V）=0.4343-0.04464pH， R2=0.9903，根據Nernst方程Epa=Eθ-[（2.303mRT）/（nF）]?pH[32]， 可求得m/n=0.93，說明電極反應過程中轉移的質子數與電子數相等; 此外，pH=4.0時，氧化峰電流達最大，因此選擇最佳pH值為4.0。

3.5.3?掃描速率的影響?測量不同掃描速率條件下CYS（CYS）在PG@GCE上的循環伏安圖，掃速在10～300 mV/s范圍內，峰電流隨著掃速的增加而增強，峰電流與掃速的平方根呈良好的線性關系， 方程可表示為Ipa（μA）=3.4492ν1/2 （mV/s）1/2-7.2590， R2=0.9974， 表明CYS在PG@GCE上的電極反應過程受擴散控制; 在較高的掃描速率范圍（200～300 mV/s）內，氧化峰電位和還原峰電位的數值均與掃速的對數呈良好的線性關系，方程可表示為Epa=0.2003lgν + 0.5787 （Epa： V， ν：V/s），R2=0.9968; Epc=0.00500.2567lgν（Epc： V， ν： V/s）， R2=0.9925。根據Lavirons方程[33，34]：

可計算出電子轉移系數α=0.43，電子轉移數n=0.53，電極反應速率常數ks=0.67/s，表明CYS在PG@GCE表面具有快速的電子轉移過程。這是由于PG具有較大的比表面積，可以增加CYS在電極表面的負載量。另外，PG優良的導電性可以促進電極表面電子的快速轉移，從而增強CYS的電化學響應信號。綜上可知，PG為CYS提供了合適的電子傳遞微環境，促進了CYS的電化學反應，從而能夠實現對CYS的靈敏測定。根據求得的電化學反應參數，進一步驗證了CYS在電極表面的反應機理。

3.5.4?富集時間的影響?將修飾電極置于含有2.8×105 mol/L CYS的醋酸鹽緩沖液（pH=4.0）中，選擇開路電位攪拌富集，每隔30 s采用循環伏安法掃描一次，CYS的還原峰電流隨著富集時間的增加而增大，在5 min后，還原峰電流增加相對較平緩。 選擇富集時間為5 min。

3.6?線性范圍和檢出限

在優化的實驗條件下，選擇靈敏度較高的差分脈沖伏安法（Differential pulse voltammetry， DPV）測定PG@GCE電極對含有不同濃度CYS溶液的響應。CYS的氧化峰電流和濃度在1.8×107～4.4×105 mol/L的范圍內呈現良好的線性關系，線性方程表示為Ip（μA）= 0.2609C （μmol/L） + 0.1187，相關系數R2=0.9928，檢出限為5.8×108 mol/L（S/N=3），與文獻報道的分析方法相比（表1），本方法分析性能或優于或相當于文獻方法。

3.7?傳感器的重現性、選擇性和穩定性研究

平行制備5支修飾電極，對相同濃度的CYS樣品溶液（2.8×105 mol/L）進行測定，各測量值間的相對標準偏差為4.4%，表明構建的傳感器具有很好的重現性。同一支修飾電極4℃保存1周后，對含有2.8×105 mol/L CYS的0.1 mol/L醋酸緩沖溶液進行測定時，其電化學響應信號為原始檢測信號的95.7%，表明此傳感器具有良好的穩定性。

考察了傳感器的選擇性。采用差分脈沖伏安法，在含有2.8×105 mol/L CYS的0.1 mol/L醋酸緩沖溶液（pH =4.0）中，分別加入槲皮素（Quercetin）和芒柄花素（Formononetin），終濃度為2.8×104 mol/L; 加入甘氨酸（Glycine）、谷氨酸（Glutamic acid）、鼠李糖（L-rhamnose monohydrate）和蔗糖（Sucrose），使其濃度為1.4×103 mol/L; 加入Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Cl、SO24等干擾離子（Trace element），終濃度為2.8×103 mol/L。 在含有較高濃度的干擾物時，構建的電化學傳感器用于CYS分析時，呈現出較佳的選擇性。

3.8?實際樣品分析

3.8.1?黃芪、紅芪中CYS（CYS）的測定?取100 μL制備的黃芪、紅芪提取物作為待測樣品，高效液相色譜法（HPLC）測定中藥材黃芪和紅芪中CYS含量為0.252和0.0765 mg/g，作為參照值。采用構建的傳感器對CYS進行分析，結果如表2所示，加標回收率在96.2%～103.4%范圍，表明PG@GCE電化學傳感器可用于實際樣品中CYS的檢測。

3.8.2?生物樣本中CYS的測定?以制備的PG@GCE為工作電極，對血漿樣品中CYS的含量進行分析。取500 μL經預處理后的血漿樣品，用0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH=4.0）稀釋至10 mL，確保待測樣品中CYS的濃度在PG@GCE工作電極分析的線性范圍內，保持整個體系處于均勻狀態，采用標準加入法，運用構建的傳感器對血漿樣品中CYS進行分析（表3），回收率在95.0%～1027%范圍內，表明PG@GCE電化學傳感器可用于生物樣本中CYS的測定。

4?結 論

制備了結構優化的中空網絡結構PG，此PG具有大的比表面積和優良的導電性，可用于構建復雜體系中CYS痕量分析的電化學傳感器，顯著增加了CYS富集的活性位點，極大增強了CYS的電化學響應。在優化條件下，PG@GCE傳感器對CYS呈現出較寬的線性范圍和較低的檢出限，以及良好的穩定性、選擇性和較好的重現性。用于中藥黃芪、紅芪的提取物及血漿樣品中CYS分析時，分析性能良好。本研究為中藥黃芪和紅芪中質量控制的指標性成分的快速檢測及生物樣品中CYS的痕量分析提供了一種新穎的分析方法，也擴大了PG在分析領域的應用。

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