小麥條銹菌效應蛋白Hasp58抑制植物免疫的功能分析

陳增菊，王 婷，湯春蕾，趙夢鑫，康振生，王曉杰

(西北農林科技大學植物保護學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)為活體專性寄生真菌，其引起的小麥條銹病破壞性極強，給小麥生產造成重大損失[1-2]。效應蛋白由病原物分泌，可轉運進寄主植物細胞內，通過改變寄主植物細胞的結構和代謝途徑調控寄主的防御反應，促進病菌的成功侵染或觸發寄主的防衛反應[3]。

病原真菌定殖于寄主植物后，被寄主的免疫系統識別，觸發寄主植物的最初防御反應。病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs )包括細菌的鞭毛蛋白、真菌細胞壁的幾丁質等病原菌保守分子[4-5]。病原真菌與寄主植物接觸后，其幾丁質聚合物與植物細胞中的幾丁質酶識別，觸發寄主植物的第一道防御反應。類似于這類由模式識別受體(PRRs)觸發的第一道防衛反應被稱為PAMPs引起的免疫反應(PAMPs-triggered immunity，PTI)[6]。該過程使寄主植物產生一系列快速響應機制，包括活性氧及胼胝質等物質的積累，這些響應程序共同促進了抗菌化合物的積累，抑制病原菌的侵染[7]。

雖然PTI作為防止病原菌侵染的第一道屏障發揮著關鍵作用，但病原菌會產生相應的毒性因子使寄主植物感病。為了抵抗病原菌進一步侵染，寄主植物產生第二道屏障即效應蛋白誘導的免疫反應(effector-triggered immunity，ETI)。該免疫反應由抗病蛋白識別效應蛋白引起，觸發寄主局部的細胞壞死或超敏(HR)等反應[8]。寄主植物自身可產生壞死阻遏病原菌蔓延，誘發寄主一系列的變化，激活下游防衛基因的表達，激發植株自身系統性獲得抗性[9-10]。植物病原菌的許多效應蛋白均可抑制寄主植物的PTI或者ETI，說明病原菌效應蛋白對調控寄主免疫反應具有重要作用[11-13]。

由于小麥條銹菌毒性小種變異快，容易導致抗病品種抗病性“喪失”，造成病害流行，因而對小麥條銹菌毒性機制以及小麥與條銹菌互作機制的研究是目前亟待解決的問題[14]。本研究從小麥條銹菌吸器轉錄組中獲得一個在吸器特異誘導表達的分泌蛋白(效應蛋白)基因Hasp58，在煙草細胞胞內瞬時表達該效應蛋白以明確其毒性功能；用煙草的細胞定位明確其空間表達特征；用細菌的三型分泌系統在小麥中瞬時表達該效應蛋白以明確其是否抑制植物免疫反應，了解效應蛋白Hasp58在條銹菌致病和生長發育過程中的毒性功能，為揭示該效應蛋白的致病機理及制定新的抗病策略奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

煙草品種為本氏煙(Nicotianabenthamiana)，由西北農林科技大學植物保護學院吳云峰教授饋贈。小麥品種分別為攜帶抗病基因YrSu的水源11以及對條銹菌高度感病的明賢169；小麥條銹菌CYR23生理小種；工程菌株為大腸桿菌(Eschrichiacoli)JM109和Top10(LB 37 ℃培養)；農桿菌菌株(Agrobactriumtumefacien)GV3101(LB 28 ℃培養)；載體材料為重組馬鈴薯X病毒(PVX)載體pGR106和用于煙草細胞定位試驗的pCAMNIA1302；均由本實驗室保存。熒光假單胞菌菌株EtHAn(KB 28 ℃培養)和用于細菌III型分泌系統介導的小麥瞬時表達的pEDV6載體，由華盛頓州立大學Scot H. Hulbert教授饋贈。

1.2 小麥條銹菌 Hasp58的序列預測及擴增

使用SignalP 4.1 Server軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測效應蛋白Hasp58的信號肽。用Primer Premier 5設計Hasp58相關引物(表1)，以條銹菌生理小種CYR32侵染的小麥葉片的cDNA為模板分別擴增Hasp58相關序列。基因擴增體系為12.5 μL的2×Taq MasterMix(CWBIO)，11.5 μL的H2O，0.5 μL的正向引物，0.5 μL的反向引物。擴增程序為95 ℃3 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 2 min，40 cycles；72 ℃10 min。

1.3 載體構建及浸染煙草

以pGR106-Hasp58-F和pGR106-Hasp58-R擴增Hasp58全長；構建pMD18-T-Simple載體；用Cla I(Fermentas)和Sal I(Fermentas)對pGR106和含有目的基因的pMD18-T-Simple重組載體進行酶切，獲得含有酶切位點的目的基因與pGR106；用T4 DNA Ligase將酶切開的目的基因與酶切開的pGR106連接，構建重組載體Hasp58-pGR106。重組載體電轉至農桿菌感受態Gv3101及侵染煙草參照Rajput等的方法[15]。Avr1b-pGR106、GFP-pGR106、BAX-pGR106載體構建方法同Hasp58-pGR106載體構建。

1.4 效應蛋白Hasp58的煙草細胞定位分析

以pCambia1302-Hasp58-NcoI-F和pCambia1302-Hasp58-SpeI-R擴增Hasp58全長(編碼蛋白為Hasp58)，以pCambia1302-Hasp58-nosp-NcoI-F和pCambia1302-Hasp58-SpeI-R擴增Hasp58-nosp(未含有Hasp58信號肽序列，編碼蛋白為Hasp58-nosp，為缺失信號肽缺失體)，構建pCAMNIA1302重組載體Hasp58-pCAMNIA1302、Hasp58-nosp-pCAMNIA1302(載體構建方法同1.3)，在煙草細胞中表達融合蛋白Hasp58-GFP、Hasp58-nosp-GFP。農桿菌感受態Gv3101的制備與轉化及侵染煙草參照Cheng等[16]的方法。48 h后撕取煙草下表皮，0.8 mol·L-1山梨醇侵泡15 min進行質壁分離，OlympusBX-53熒光顯微鏡觀察。

1.5 效應蛋白Hasp58對寄主PTI和ETI瞬時表達效應測定

以pEDV6-Hasp58(nosp)-F和pEDV6-Hasp58(nosp)-R擴增Hasp58-osp，構建pEDV6重組載體(Hasp58nosp-pEDV6)(載體構建方法同1.3)。重組載體轉化至熒光假單胞EtHAn參照Cheng等[17]的方法。所得熒光假單胞EtHAn培養液用10 mM MgCl2溶液處理，處理方法參照Cheng等[17]的方法。將處理好的菌液用10 mM MgCl2溶液稀釋至OD600為1.0，室溫放置2 h。

1.5.1 胼胝質(Callose)積累的觀察

用處理好的熒光假單胞菌EtHAn侵染小麥明賢169，25 ℃培養。24 h后采集葉片，用無水乙醇∶冰醋酸(1∶1)脫色液脫色、水飽和氯醛透明、0.05%苯胺藍染液染色，熒光顯微鏡觀察胼胝質積累。每個樣品隨機選取50個1 mm2的視野，統計胼胝質的點數，三次生物學重復。

1.5.2 活性氧積累、細胞壞死及條銹菌菌絲發育的觀察

用處理好的熒光假單胞菌EtHAn侵染小麥水源11，24 h后接種條銹菌無毒性生理小種CYR23，接種后24 h、48 h采集葉片。

將所采集葉片于3,3-二氨基聯苯(3,3′-diaminobenzidine，DAB)中光照6～8 h染色；浸泡于脫色液中脫色，在水飽和氯醛溶液中透明；顯微鏡觀察H2O2積累和細胞壞死情況。每個樣品統計30個侵染點，三次生物學重復。

將所采集葉片脫色、透明后，加入1.0 M的KOH溶液，121 ℃高壓滅菌5 min，ddH2O沖洗2次，50 mM的Tris-HCl(pH 7.0)緩沖液浸泡30 min，WGA-Alexa 488熒光染料染色30 min，50 mM的Tris-HCl緩沖液和ddH2O沖洗，浸泡于50%甘油中保存，顯微鏡觀察菌絲長度及菌落面積。每個樣品統計30個侵染點，三次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 Hasp58的序列分析

在吸器特異誘導表達的分泌蛋白(效應蛋白)基因Hasp58的cDNA序列全長1 026 bp(圖1)，編碼342個氨基酸(圖2)。使用Signal P 4.1 Server對Hasp58預測，發現其信號肽位于N端的1～26個氨基酸的位置(圖2)。

2.2 Hasp58抑制細胞壞死的毒性功能分析

用攜帶重組載體(基因-pGR106)的農桿菌侵染煙草，24 h后注射入BAX(小鼠細胞調亡前體蛋白)，6 d后照相。如圖3所示，空載體PVX和eGFP為陰性對照，均不抑制壞死；大豆疫霉的Avr1b為陽性對照，抑制BAX誘導的壞死。效應蛋白Hasp58抑制BAX誘導的PCD，說明其具有潛在的毒性功能。

表1 試驗用引物Table 1 Primers used in this test

圖1 Hasp58的cDNAFig.1 cDNA of Hasp58

下劃線部分為信號肽 The underlined part is the signal peptide.

圖2Hasp58的氨基酸序列

Fig.2AminoacidsequenceofHasp58

2.3 Hasp58的煙草細胞定位分析

將缺失信號肽Hasp58-nosp和Hasp58分別與GFP在煙草細胞中融合表達。如圖4，質壁分離后，GFP在煙草細胞細胞質及細胞核有分布，Hasp58-nosp-GFP和Hasp58-GFP均在胞質中分布，說明Hasp58定位在煙草細胞胞質。

2.4 Hasp58表達后寄主植物的胼胝質沉積分析

將Hasp58nosp-pEDV6在熒光假單胞菌EtHAn中表達后，細菌通過其三型分泌系統將Hasp58nosp分泌到小麥明賢169葉片中，胼胝質作為PTI的代表。胼胝質的分布情況如圖5，統計結果如圖6。DsRed和AvrRpt2分別作為陰性對照和陽性對照。如圖6所示，與陰性對照dsRed對比，用含有重組蛋白Hasp58菌液處理的小麥明賢169，其葉片胼胝質點數顯著性降低，說明該效應蛋白可以抑制小麥的PTI反應。

圖3 Hasp58可以抑制BAX誘導的PCDFig.3 Hasp58 inhibits BAX-induced PCD

圖4 Hasp58定位在胞質(紅色箭頭為質壁分離位點)Fig.4 Localization of Hasp58 in cytoplasm(red arrows indicate the plasmolysis sites)

2.5 Hasp58表達后寄主植物的活性氧積累、細胞壞死及條銹菌菌絲發育分析

同2.4，小麥條銹菌Hasp58及對照蛋白表達后，活性氧積累和細胞壞死面積統計結果如圖8和圖9，菌絲長度以及菌落面積大小如圖10。同對照dsRed對比，注射效應蛋白Hasp58 48 h后，小麥葉片細胞壞死面積和活性氧積累顯著減少，表明效應蛋白Hasp58可以抑制小麥的ETI反應。同對照dsRed相比，注射效應蛋白Hasp58 48 h后，條銹菌的菌絲面積顯著性增加，注射該效應蛋白48 h和24 h后的菌絲長度及24 h后的菌絲面積均增加，表明效應蛋白Hasp58可以促進條銹菌的生長。

圖5 熒光顯微鏡下AvrRpt2、dsRed和效應蛋白Hasp58的胼胝質積累(標尺：200 μm)Fig.5 Callose deposition of AvrRpt2,dsRed and effector Hasp58 under fluorescence microscope(bars：200 μm)

**:與dsRed差異在0.01水平顯著。

**:Significant difference with dsRed at 0.01 level.

圖6AvrRpt2、dsRed和效應蛋白Hasp58胼胝質積累差異

Fig.6DifferenceofcallosedepositsofdsRed,AvrRpt2andeffectorHasp58

3 討 論

效應蛋白是一類由病原菌分泌的小分子蛋白，通過抑制寄主的免疫反應促其致病,是病原物侵染寄主的關鍵毒性因子。目前，許多病原物的效應基因被鑒定并確定功能，僅少數銹菌的效應基因被鑒定，被鑒定的銹菌效應蛋白主要來自亞麻銹菌等其他幾種銹菌[18-19]。Hasp58為小麥條銹菌吸器特異誘導表達的分泌蛋白，為新挖掘的效應基因編碼蛋白，研究其在小麥條銹菌致病過程中的作用可為制定新的抗病策略奠定基礎。

BAX誘導產生的PCD與植物產生的HR相似，近年來被廣泛用于效應蛋白的毒性功能研究[20-22]。本研究借助煙草瞬時表達系統，發現條銹菌效應蛋白Hasp58能夠抑制煙草PCD，確定其潛在的毒性功能。

圖7 效應蛋白Hasp58抑制小麥的ETI反應的組織學觀察(標尺：200 μm)Fig.7 Histological observation of Hasp58 suppressing ETI(bars:200 μm)

*:Hasp58與陰性對照dsRed差異在0.05水平顯著。下圖同。

*:Difference between the Hasp58 and the negative control dsRed was significant at 0.05 level. The same in figures 9 and 10.

圖8條銹菌效應蛋白Hasp58對小麥ETI反應活性氧積累的影響

Fig.8EffectofPsteffectorHasp58ontheaccumulationofactiveoxygeninETIreaction

圖9 條銹菌效應蛋白Hasp58對小麥ETI反應HR積累的影響Fig.9 Effect of Pst effector Hasp58 on the accumulation of HR in ETI reaction

A：菌絲面積；B：菌絲長度。A:Hypha area; B:Hypha length.

病原菌效應蛋白分為胞內效應蛋白和胞外效應蛋白，胞內效應蛋白可以被轉運進寄主細胞中發揮功能[23]。含有RXLR和CRN基序的卵菌效應蛋白可以轉運進寄主細胞胞內[24]。本試驗通過煙草的細胞定位實驗確定Hasp58定位在植物細胞胞內，說明其在細胞胞內定位并具有潛在的轉運功能。

PTI是病原分子相關模式誘導的免疫反應，為先天抗病性，是寄主防御病原物的第一層屏障。卵菌和細菌的許多效應基因均可以通過不同的機制抑制寄主的PTI[25-26]。細菌的某些效應基因編碼效應蛋白的靶標為PTI防衛信號通路的相關蛋白[27]。小麥條銹菌效應蛋白PSTha5a23在小麥與條銹菌互作中抑制寄主的PTI[17]。Hasp58為條銹菌吸器分泌蛋白，說明病原菌已經突破寄主的第一道屏障，產生吸器，分泌Hasp58發揮功能。本研究結果表明，Hasp58可抑制寄主的PTI，這可能是因為Hasp58在突破寄主第一道屏障前通過靶標病原物的相關蛋白傳遞信號，發揮抑制寄主PTI的毒性功能。

ETI是寄主防御病原物的第二層屏障，病原物的效應基因編碼產物可以通過靶標相關蛋白，激活相關信號通路，抑制寄主的ETI反應[12，28]。本研究發現，Hasp58可以抑制寄主的ETI并促進自身侵染，推測其可能通過靶標寄主防御信號通路的蛋白發揮其抑制寄主ETI的毒性功能。本研究結果可為揭示小麥條銹菌致病機理及制定防治小麥條銹菌策略奠定基礎。