黃刺玫果提取物對小鼠急性酒精性氧化應激反應的影響※

薛潤苗 張文琴 王 美 王曉燕

酒精性肝病是我國常見的肝臟疾病之一[1]，其發病涉及多種機制，但脂質過氧化是酒精性肝損傷的早期表現[2]。黃刺玫果為薔薇科薔薇屬野生落葉灌木黃刺玫（Rosa xanthina Lindl.）的成熟果實，廣泛分布于我國北方各省的山區和丘陵地帶[3]。眾多研究表明，刺玫果具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力等多種生物學功能[4-7]。本研究探討黃刺玫果提取物的抗氧化作用，為黃刺玫果開發功能性食品提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品黃刺玫果提取物（由本課題組自行制備：挑選、清洗黃刺玫鮮果→破碎→料液比為1∶5的70%乙醇提取1.0 h→過濾→濾液濃縮至目標濃度→6000 r/min離心15 min→冷凍干燥→粉碎）。

1.1.2 實驗動物昆明小鼠50只，清潔級，雄性，體重18～22 g，購自中國食品藥品檢定研究院，許可證號：SCXK（京）2014-0013，實驗環境溫度（22.0±2.0）℃，相對濕度（50±10）%。

1.1.3 主要儀器與試劑BSM-220.3電子天平（上海卓精電子科技有限公司）；高剪切分散乳化機（上海弗魯克流體機械制造有限公司）；TGL-18臺式高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；全自動生化分析儀（Awareness Technology，inc.Palm City，FL34990）；Infinite M200 Pro多功能酶標儀（Chemwell Industry Co.,Ltd）。

總蛋白定量試劑盒（貨號：A045-4，批號：20170413）；丙二醛（MDA）試劑盒（貨號：A003-1，批號：20170323）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號：A001-3，批號：20070413）；谷胱甘肽（GSH）試劑盒（貨號：A006-2，批號：20170325）；蛋白質羰基含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20170414）；無水乙醇（分析純，天津市北辰方正試劑廠）；乙酸乙酯（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組適應性飼養7 d后，將小鼠隨機分為5組，每組10只，分別是空白對照組、模型組及黃刺玫果提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組。

1.2.2 模型制備每日1次經口灌胃給予低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠黃刺玫果提取物500、1000 、2000 mg/kg（相當于人體推薦劑量的5、10、20倍），空白對照組及模型組給予等體積蒸餾水。連續灌胃30 d，每3天稱1次體重，按體重調整給藥劑量。第31天造模，5組小鼠禁食16 h（過夜）后1次性灌胃給予50%乙醇12 ml/kgBW（空白對照組不作處理，不禁食）。

1.2.3 樣品采集給予乙醇6 h后，摘眼球取血，以3500 rpm 離心15 min（離心半徑為13.5 cm），離心后分離血清備用。解剖取肝臟，剔除筋膜后在預冷的滅菌 0.9%氯化鈉注射液中漂洗并用濾紙吸干水分，切取同一部位肝組織0.4 g加3.6 ml滅菌冰0.9%氯化鈉注射液以3500 rpm 離心15 min，離心后取上清液備用。采用試劑盒分別測小鼠血清和肝組織中SOD、GSH、MDA及蛋白質羰基含量。

1.3 結果判定

根據《保健食品檢驗與評價技術規范—2003》判定，在模型成立的前提下，SOD、GSH、MDA、蛋白質羰基含量任意三項為陽性，可判定受試樣品抗氧化動物實驗結果陽性。

1.4 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，采用方差分析，先進行方差齊性檢驗，方差齊，組間比較采用F檢驗，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義；對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，再進行統計學分析；若變量轉換后仍未達正態或方差齊，改用秩和檢驗。

2 結果

2.1 5組小鼠給藥前后體重比較

給藥前，5組小鼠體重比較差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥后，5組小鼠體重與給藥前比較均明顯增加（均P＜0.05），但組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 5組小鼠給藥前后體重比較(g,±s)

表1 5組小鼠給藥前后體重比較(g,±s)

注：與給藥前比較，aP＜0.05

組別 只數 給藥前 終末體重空白對照組 10 27.85±2.10 37.07±3.55a模型組 10 29.00±1.42 37.20±4.76a低劑量組 10 28.16±2.71 37.19±3.03a中劑量組 10 29.10±1.92 38.21±1.74a高劑量組 10 28.66±2.00 38.79±2.39a

2.2 黃刺玫果提取物對小鼠血清中 SOD活力及GSH、MDA、蛋白質羰基含量的影響

模型組和空白對照組比較，小鼠血清中SOD活力、GSH含量均顯著降低，MDA 、蛋白質羰基含量均顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），說明乙醇氧化模型造模成功。小鼠血清中SOD活力，各劑量組與模型組比較均顯著升高（P＜0.05）；GSH含量，中劑量組和大劑量組與模型組比較均顯著升高（P＜0.05）；MDA含量，各劑量組與模型組比較有所下降，其中中劑量組和大劑量組下降顯著（P＜0.05）；蛋白質羰基含量，各劑量組與模型組比較有所下降，其中中劑量組和大劑量組下降顯著（P＜0.05），差異均有統計學意義。見表2。

表2 黃刺玫果提取物對小鼠血清中SOD活力及GSH、MDA、蛋白質羰基的影響(±s)

表2 黃刺玫果提取物對小鼠血清中SOD活力及GSH、MDA、蛋白質羰基的影響(±s)

注：與模型組比較，aP＜0.05

組別 只數 SOD活力(U/ml) GSH含量(μmol/L) MDA含量(Nmol/ml) 蛋白質羰基含量(Nmol/mgprot)空白對照組 10 21.44±0.76a 279.07±58.20a 36.75±1.13a 0.40±0.06a模型組 10 20.24±1.23 229.92±43.19 37.81±1.07 0.57±0.17小劑量組 10 20.43±0.80a 228.48±23.48 37.27±0.82 0.45±0.18中劑量組 10 21.37±0.62a 269.40±32.65a 36.85±0.92a 0.38±0.17a大劑量組 10 21.45±0.79a 285.45±51.71a 36.76±0.99a 0.38±0.13a

表3 黃刺玫果提取物對小鼠肝臟組織中SOD活力及GSH、MDA、蛋白質羰基含量的影響(s)

表3 黃刺玫果提取物對小鼠肝臟組織中SOD活力及GSH、MDA、蛋白質羰基含量的影響(s)

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 只數 SOD活力(U/ml) GSH含量(μmol/L) MDA含量(Nmol/ml) 蛋白質羰基含量(Nmol/mgprot)空白對照組 10 155.51±11.36a 6.37±1.43a 19.85±3.02a 0.50±0.13a模型組 10 134.85±18.21 5.24±0.73 23.62±3.83 0.69±0.17小劑量組 10 147.22±16.79 5.18±0.97 20.26±3.65 0.57±0.13中劑量組 10 156.95±18.66a 6.16±1.13a 20.80±2.28 0.47±0.23a大劑量組 10 164.50±19.29ab 6.37±1.85 20.52±2.84 0.50±0.16a

2.3 黃刺玫果提取物對小鼠肝臟組織中 SOD活力及GSH、MDA、蛋白質羰基含量的影響

模型組與空白對照組比較，小鼠肝臟組織中SOD活力、GSH含量均顯著降低，MDA含量、蛋白質羰基含量均顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），說明乙醇氧化模型造模成功。小鼠肝臟組織中SOD活力，各劑量組與模型組比較均有所升高，其中中劑量組升高明顯（P＜0.05），大劑量組更明顯（P＜0.01）；中劑量組與模型組的GSH含量比較，升高顯著（P＜0.05）；各劑量組MDA含量與模型組比較有所降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；蛋白質羰基含量，各劑量組與模型組比較均有所降低，其中中劑量組和大劑量組降低顯著（P＜0.05），差異有統計學意義。見表3。

3 討論

大量乙醇一次性進入人體后，在乙醇脫氫酶催化下脫氫氧化為乙醛和乙酸鹽，使三羧酸循環障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝。乙醇損傷各種細胞器和酶的結構功能，引起脂質過氧化反應，抑制谷胱甘肽的生物合成，減弱超過氧化酶的抗氧化能力[8]，乙醇還能激活氧分子產生自由基，導致組織細胞過氧化效應及體內還原性谷胱甘肽的耗竭。SOD是存在于生物體內的一種重要的金屬酶，其能催化生物氧化而產生的超氧陰離子轉化為 H2O2和H2，再由其他抗氧化酶作用生成水，這樣可以清除O2-對細胞的損傷作用[9]。MDA是脂質過氧化反應的產物，可間接反應體內自由基生成與清除的平衡狀態[10]。GSH是一種抗氧化劑，對自由基具有較強清除作用[11-12]，缺乏或耗竭GSH會促使許多化學物質或環境因素產生中毒作用，GSH含量是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素[13]。蛋白質羰基形成是多種氨基酸在蛋白質的氧化修飾過程中的早期標志，隨著年齡增長而增加，其可直接反映蛋白質氧化損傷的程度[14]。

本研究結果顯示，給藥后對小鼠體重的影響不顯著；乙醇氧化模型造模成功；中劑量組和大劑量組小鼠血清中SOD活力及GSH、MDA、蛋白質羰基含量與模型組比較，結果陽性；中劑量組、大劑量組小鼠肝組織中SOD活力及GSH、蛋白質羰基含量與模型組比較，結果陽性。

綜上所述，根據《保健食品檢驗與評價技術規范—2003》判定黃刺玫果提取物對小鼠急性酒精性氧化應激反應具有抗氧化作用。