PTEN-Long在腫瘤治療中的研究進展△

耿連婷，李春暉，單小松，鄭亞北，曾昭穆，鄭克彬#

1河北大學醫學院，河北 保定071000

2河北大學附屬醫院神經外科，河北 保定0710000

第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是繼p53基因之后又一經典的腫瘤抑制基因，在許多腫瘤中存在缺失或突變，如PTEN磷酸酶結構域中的3個單個氨基酸突變：C124S（脂質磷酸酶和蛋白磷酸酶活性均喪失）、G129E（僅保留蛋白磷酸酶活性而喪失脂質磷酸酶活性）和Y138L（僅保留脂質磷酸酶活性而蛋白磷酸酶活性喪失）[1-2]。PTEN-L/PTENα、PTEN-M/PTENβ、PTEN-N和PTEN-O是PTEN的4種更長的同工型蛋白產物，它們的起始密碼子均位于PTEN經典起始密碼子ATG的上游[3]。PTEN-L是2013年Hopkins等[4]發現的一種PTEN翻譯變體，與PTEN具有相似的生物活性，發揮腫瘤抑制的作用，是目前研究的重點。對于腫瘤的治療存在各種各樣的困難，基因治療目前越來越受到重視。

1 PTEN和PTEN-L的結構與功能

1.1 結構

PTEN基因位于人類染色體10q23.31上，由3個結構域組成：N-末端磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）結合序列（殘基1～7）；雙重特異性磷酸酶結構域（由第14～185位氨基酸組成）和C2結構域（由第190～351位氨基酸組成）；含有多個磷酸化位點的50個氨基酸C-末端（由第353～400位氨基酸組成）和C端PDZ結合序列（由第401～403位氨基酸組成）[5]。編碼PTEN的mRNA上翻譯的起始密碼子為ATG，編碼一個由403個氨基酸組成的蛋白質。PTEN-L在其N端上游513 bp處選擇了非經典翻譯起始密碼子CTG，編碼一個由576個氨基酸組成的蛋白質，相對于PTEN，PTEN-L在其N端多出了173個氨基酸，表達產物的分子量為75 kD，并且該173個氨基酸序列與其他物種預測蛋白序列的對比結果表明PTEN-L在進化過程中高度保守[4]。

1.2 功能

PTEN-L也是一種抑癌基因，在腫瘤細胞中的相對表達量較低。與PTEN相似，PTEN-L以磷酸酶活性依賴性的方式通過阻斷磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號轉導通路，降低PI3K/AKT信號轉導通路的磷酸化水平，并且PTEN-L具有更強的磷酸酶活性。特殊的是，PTEN-L比PTEN多編碼的173個氨基酸使PTEN-L具有細胞穿透和細胞分泌的作用。該額外序列含有多聚丙氨酸序列，似乎起到了通過經典途徑發揮細胞分泌的作用，而且計算機模擬顯示PTEN-L額外序列中含有分泌信號序列。在細胞外如細胞培養基、血漿、血清中可檢測到PTEN-L的存在。有研究證明，PTEN-L可由細胞內分泌到細胞外。人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）具有轉錄激活因子蛋白的細胞穿透元件的多堿性殘基。PTEN-L多編碼的173個氨基酸中具有與該多堿性殘基相似的區段，使PTEN-L具有穿透細胞膜的作用，可進入相鄰細胞，并使PTEN-L作為外源藥物或攜帶其他外源藥物影響細胞信號的傳導，阻斷PI3K/AKT信號轉導通路，從而抑制腫瘤細胞的生長，誘導腫瘤細胞凋亡[4]。

2 PTEN-L信號轉導通路

PTEN是在多種類型的腫瘤中存在突變的腫瘤抑制因子，其編碼的蛋白具有雙重特異性磷酸酶的活性，其主要底物是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate，PIP3）[6]，PTEN可使PIP3去磷酸化，抑制PI3K信號的傳導，從而影響腫瘤細胞的生長、增殖和存活[7]。PTEN-L和PTEN具有相似的生物活性，作為PI3K抑制劑，可通過阻斷PI3K/AKT信號轉導通路及其下游信號轉導通路發揮腫瘤抑制作用，如通過抑制PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）信號轉導通路，影響腫瘤細胞的發生發展、核糖體生物合成、血管生成、自噬及凋亡等過程[8-9]，還可阻斷 PI3K/AKT/核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號轉導通路，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡。PTEN不但可通過阻斷黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）信號轉導通路從而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，還可通過阻斷促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉導通路抑制腫瘤的生長和分化，但PTEN-L是否可以通過此途徑發揮腫瘤抑制作用有待進一步研究[10]。

3 PTEN-L前導序列在腫瘤治療中的應用及發展

3.1 PTEN-L前導序列融合蛋白的組裝前景

PTEN-L N-末端的173個氨基酸被稱為前導序列。PTEN-L前導序列本質上是無序的，并且富含翻譯后修飾，可被分泌到細胞外液中，并可重新進入鄰近細胞或遠處細胞，在體內和體外發揮與PTEN相似的腫瘤抑制作用，增加了PTEN治療疾病的可行性[11]。腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）是一種強大的腫瘤抑制因子。研究顯示，將PTEN-L前導序列與轉錄調節因子TP53結合可組裝為融合蛋白PTEN-L-p53，PTEN-L-p53可被分泌至細胞外并穿過受體細胞膜屏障定位于細胞質和細胞核中。PTEN-L前導序列不影響TP53的功能，PTEN-L-p53可顯著抑制U251細胞的增殖、侵襲和遷移，發揮腫瘤抑制因子的作用。該融合蛋白由具有低免疫原性的內源性蛋白質和內源性肽段組成，有希望應用于TP53異常的腫瘤治療[12]。用健康的基因取代突變的基因治療疾病是很有前景的[13]，與各種人內源蛋白（p53、p16、p21等）融合的PTEN-L前導序列可有效遞送治療性蛋白質，避免了傳統載體的缺點，被認為是用于遞送治療性蛋白質的有效載體，為治療腫瘤提供了一種新穎且直接的方法。

3.2 PTEN-L前導序列工程化版本的構建

PTEN在膠質母細胞瘤中多處于失活狀態，膠質母細胞瘤細胞系中PTEN活性的恢復可使腫瘤細胞的增殖和遷移減少，同時對凋亡的易感性增加。多項研究已對PTEN活性的恢復在U87MG細胞中的作用進行了研究，結果顯示，PTEN可抑制U87MG細胞的增殖、遷移等[14-16]。PTEN-L可通過外泌體或者裸蛋白的形式分泌并被相鄰細胞攝取，因此，PTEN-L可作為恢復PTEN活性的治療劑，但是，有效透過血-腦脊液屏障遞送治療性蛋白質以治療中樞神經系統腫瘤具有一定的難度，單核細胞/巨噬細胞、間充質干細胞和神經干細胞具有一定的細胞歸巢能力[17-20]，如果將這些細胞工程化以表達治療性蛋白質，則有可能利用這些細胞的歸巢能力以局部持續高濃度的方式遞送治療性蛋白質。有研究表明，神經干細胞通過遺傳修飾表達治療性蛋白質可能能夠解決血-腦脊液屏障的問題。另一個問題是，PTEN-L中的聚氨基酸可能是通過脊椎動物進化階段的核苷酸重復擴增而產生的。核苷酸的積累可以通過自然選擇優勢來驅動，也可能未通過負選擇或遺傳漂移而保留下來[21]。這些過程均可能會限制PTEN-L的細胞分泌能力和穿透能力。有研究開發出了一種工程化版本的PTEN-L，它被設計用于增強細胞介導的遞送，具有很強的分泌能力和轉移至鄰近細胞的能力，而這是通過采用來自人輕鏈免疫球蛋白G的前導序列替換PTEN-L的天然前導序列來實現的[22]。源自人成纖維細胞的神經干細胞可以被修飾以表達PTEN-L，并作為膠質母細胞瘤中蛋白質遞送的載體[20,23-25]，且能夠將輕鏈前導序列PTEN-L（lightchain leader PTEN-L，lclPTEN-L）遞送至鄰近的成膠質細胞瘤細胞。此工程化版本解決了膠質母細胞瘤中由于血-腦脊液屏障引起的藥物吸收障礙的問題，并且穩定了PTEN-L前導序列的細胞間轉移能力，發揮了細胞介導的蛋白質遞送的潛力。

4 PTEN-L在腫瘤治療中的探索

4.1 PTEN-L和tGAS 1的聯合腫瘤抑制作用

PTEN的表達產物為雙特異性磷酸酶，具有腫瘤抑制的作用，通過使PIP3去磷酸化來抑制PI3K的活性，還可以獨立于PI3K調節細胞外調節蛋白激酶 1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2），是最重要的腫瘤抑制因子之一[26-28]。特異性生長抑制蛋白1（growth arrest-specific 1，GAS1）是一種分子量為37 kD的蛋白質，在神經膠質細胞瘤等多種腫瘤中呈過表達，可誘導細胞周期停滯和細胞凋亡[29]，并明顯抑制膠質細胞源性神經營養因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）誘導的Tyr1062位點的RET的磷酸化，導致AKT磷酸化水平降低，促進B細胞淋巴瘤/白血病-2相關死亡促進因子（B cell lymphoma/leukemia-2 associated agonist of cell death，BAD）的去磷酸化和細胞色素C釋放至細胞質中，激活caspase 9和caspase 3，進而誘導細胞凋亡，降低了ERK1/2的活性[30-32]。GAS1和PTEN均能夠抑制PI3K/AKT和ERK1/2的活性，而且PTEN和GAS1過表達對腫瘤的抑制作用具有累加效應。tGAS1是一種截短的可分泌的GAS1，具有誘導細胞周期停滯和細胞凋亡及自分泌和旁分泌的優點，可誘導產生tGAS1的細胞及鄰近腫瘤細胞凋亡，擴大GAS1的有效作用范圍[32-34]，此特點與PTEN-L相似。有研究顯示，通過慢病毒載體同時過表達等量的tGAS1和PTEN-L[35]，比單獨表達tGAS1和PTEN-L更能有效地抑制U87的生長，且優于GAS1和PTEN的抑制腫瘤的作用，降低了AKT和ERK1/2的活性[36]。tGAS1和PTEN-L聯合應用的效果優于單獨應用，表明它們在誘導腫瘤細胞凋亡方面具有累加效應。

4.2 肝細胞癌

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是發生肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的危險因素。在HCC中經常存在PTEN的突變與缺失。研究表明，PTEN-L過表達后可以抑制HCV的復制。重要的是，細胞外PTEN-L蛋白質能夠以劑量依賴的方式抑制HCV的復制。脂質磷酸酶活性喪失的G129E突變體可以如野生型PTEN一樣有效地抑制HCV的復制，而蛋白磷酸酶活性喪失的Y138L和蛋白、脂質磷酸酶活性喪失的C124S突變體無法抑制HCV的復制[37]。將PTEN的某些點突變轉移至PTEN-L中的相應位置，結果顯示，C297S和Y311L突變的PTEN-L蛋白不能抑制HCV的復制，但是，G302E突變的蛋白具有與野生型PTEN-L相同的抑制效應。結果表明，PTEN和PTEN-L中的3種氨基酸的功能在抑制HCV復制過程中是保守的，HCV核心蛋白通過第50位的精氨酸殘基與PTEN相互作用從而發揮對HCV復制的抑制效應[37-38]。有研究顯示，PTEN-L可通過PI3K/AKT途徑抑制HepG2肝癌細胞的生長[39]。

通常認為通過腺病毒將PTEN的cDNA重新引入PTEN基因缺陷的患者體內，可以抑制因PI3K/AKT信號轉導通路過度活化導致的腫瘤發生[40]，但是，腺病毒介導的基因治療存在安全隱患，有相當一部分患者出現了由腺病毒導致的不良反應。因此，PTEN-L蛋白治療可以避免因腺病毒介導所引起的不良反應，而且PTEN-L具有與內源性蛋白質相同的氨基酸序列，避免了免疫原性的發生風險[41-42]。

4.3 腎透明細胞癌

PTEN-L在腎透明細胞癌的發展中起著重要的作用。有研究發現，與癌旁正常腎組織相比，腎透明細胞癌組織中PTEN-L的表達水平明顯降低，磷酸化的 AKT（phosphorylated AKT，pAKT）的表達水平明顯升高，二者的表達水平呈負相關（P＜0.05）。在PTEN和PTEN-L的脂質磷酸酶活性的作用下，與相應的正常腎組織相比，腎透明細胞癌組織中pAKT的表達水平幾乎增加了兩倍。PTEN-L活性的下降導致PI3K/AKT信號轉導通路被激活，AKT磷酸化水平升高，進而激活一系列下游信號轉導通路，促進了腫瘤的發展。另外，該研究通過脂質體轉染，使PTEN-L在腎透明細胞癌細胞786-0中過表達后阻斷PI3K/AKT信號轉導通路，從而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，最終誘導腫瘤細胞發生凋亡。將PTEN、PTEN-L純化蛋白質加入到無PTEN活性的腎癌細胞786-0的培養基中，PTEN-L蛋白可進入細胞內，通過其脂質磷酸酶活性抑制細胞內信號的傳導，抑制PI3K/AKT信號轉導通路，并誘導細胞凋亡；但PTEN蛋白并無這樣的效果，并且PTEN-L純化蛋白質可抑制異種移植瘤小鼠模型中786-0細胞的增殖，表明PTEN-L能夠作為蛋白質治療劑在體內及體外發揮腫瘤抑制的作用[43]。

4.4 膠質細胞瘤

PTEN-L在人腦膠質瘤中發揮著重要的作用。U87是無PTEN活性的人腦膠質瘤細胞，避免了內源性PTEN在細胞中的干擾。有研究發現，采用CRISPR/Cas9基因編輯工具結合單鏈模板，將編輯PTEN-L的起始密碼子CTG改為ATG，在轉染的全細胞裂解物和濃縮的細胞培養基中，通過Western blot可檢測到PTEN-L的表達，而且與野生型U87或對照培養基相比，PTEN-L過表達可以降低AKT的磷酸化水平，抑制U87細胞的增殖。表明PTEN-L可以以旁分泌的方式進入鄰近細胞以阻斷PI3K/AKT信號轉導通路，從而抑制U87細胞的增殖[42]。因此，對于不表達PTEN或攜帶基因突變的一些腫瘤細胞，可以在其他細胞中促進PTEN-L的表達，從而誘導腫瘤細胞發生凋亡。

5 問題與展望

PTEN-L具有雙特異性磷酸酶活性，其表達產物可抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等，并可通過阻斷PI3K/AKT信號轉導通路發揮腫瘤抑制作用，但其他分子機制有待進一步深入研究。雖然在異種移植瘤小鼠模型中證實了PTEN-L的治療效果，但仍應建立一種前瞻性動物模型[43]，即構建PTEN-L缺失的動物模型，通過與PTEN-L正常表達的動物模型進行對比，研究PTEN-L缺失與腫瘤發生、發展的關系，從病因學的角度探索PTEN-L的腫瘤抑制作用。

有研究顯示，通過直接在腫瘤內注射慢病毒載體可以使tGAS1和PTEN-L過表達。tGAS1和PTEN-L從細胞中被釋放出來后通過自分泌和旁分泌的形式擴大了GAS1和PTEN的治療范圍[36]。由于蛋白質的產生和釋放發生于腫瘤內，因此認為它們在腫瘤外發生擴散并引起不良反應的發生率很低。但腺病毒介導的基因治療存在安全隱患，會發生不同程度的不良反應。因此，目前通過以具有腫瘤細胞歸巢能力的神經干細胞為載體來表達PTEN-L從而發揮治療疾病的作用，減少不良反應的發生風險。雖然PTEN-L前導序列賦予了PTEN-L直接遞送蛋白質的能力，但PTEN-L的細胞間轉移能力不穩定，用人輕鏈IgG的前導序列替換PTEN-L的天然前導序列可增強細胞的分泌和轉移能力，并且可穩定PTEN-L前導序列的細胞間轉移能力，優化細胞介導的蛋白質遞送能力[22]。因此，目前通過以神經干細胞為載體表達人輕鏈IgG前導序列的PTEN-L成為目前的研究趨勢和重點。

除此之外，PTEN-L的蛋白磷酸酶活性也在腫瘤的發生、發展中起著重要的作用，研究表明，PTEN-L可以使pSer65-Ub去磷酸化，該過程抵消了PINK1介導的泛素磷酸化，從而發揮抑制線粒體自噬的作用。PTEN-L的這種新功能為解決控制線粒體自噬這一問題提供了思路，為涉及此過程的疾病（包括神經退行性疾病）的治療提供了方向[44]，但仍需進行相關具體機制的探索，為臨床治療提供依據。PTEN還可以發揮炎性介質的作用，而對于PTEN-L是否具有此類作用及其相關機制尚不完全清楚。綜上所述，PTEN-L不僅在腫瘤的治療中發揮著重要的作用，在其他相關疾病的治療中也具有重要的意義。PTEN-L其他的生物學特性及調控機制仍需進一步研究，其可能是基因治療的優勢潛在靶點。