溫度及培養基對黃花棘豆種子萌發及幼苗生長的影響

王玉琴，尹亞麗，鮑根生，宋梅玲，王宏生

(1.省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016； 2.青海省青藏高原優良牧草種質資源利用重點實驗室，青海省畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016)

黃花棘豆(Oxytropisochrocephala)是豆科(Leguminosae)棘豆屬(Oxytropis)多年生草本植物，該植物全草有毒，廣泛分布于甘肅、青海、寧夏、西藏等地區[1]，其根系發達，籽多，生命力強，常呈片狀集中分布，并不斷的滋生蔓延，并與優良牧草爭奪生境，使得優良牧草比例下降，草地生態遭到嚴重破壞。苦馬豆素(swainsonine，SW)是黃花棘豆的主要有毒成分，動物長期或過量采食可損害中樞神經系統，影響牲畜繁殖能力和畜種改良，并致使牲畜運動和自控功能降低以致引起肌肉麻痹，乃至窒息死亡[2-4]，極大地降低了草地的利用率，給整個黃花棘豆危害區的畜牧業造成了巨大的經濟損失。目前，通過人工挖除、火燒、應用除草劑以及生物防治等方法來控制黃花棘豆對放牧動物的危害[5]，但由于缺乏對黃花棘豆的繁殖擴散機理和動物中毒機理的深入了解，因而仍不能從根本上控制棘豆的危害。

研究報道黃花棘豆除了含有有毒成分苦馬豆素外，還具有豐富營養價值。王凱[6]報道青海3種棘豆均含有較高的蛋白質，其中黃花棘豆的蛋白質含量接近于上等苜蓿。沈明華等[7-9]的研究表明黃花棘豆的粗蛋白含量接近或超過上等苜蓿干草，且具有較高的粗脂肪、總磷含量顯著高于青海；研究還表明7，8和9月采集的黃花棘豆所含蛋白質均較高，其蛋白質含量超過或接近苜蓿干草，且7月的蛋白質含量最高，9月的粗脂肪含量最高，黃花棘豆是一種潛在的高蛋白質優質牧草資源。因此，人們一直尋找有效措施對黃花棘豆進行脫毒處理，從而最大限度的利用黃花棘豆。Oldrup等[10]和周啟武等[11]研究發現在瘋草種子的糊粉層及內皮薄壁層分布著內生真菌，而種子胚體中沒有內生真菌的分布。Creamer R等[12]研究發現瘋草內生真菌分布在剝離下來的種皮或薄壁組織層中，而在剝離種皮的種子中沒有分布，且He等[13]將小花棘豆種子去皮后進行組織培養，獲得了無毒小花棘豆植株。因此，結合前人的研究結果，為了進一步研究黃花棘豆的脫毒技術，對黃花棘豆種子進行剝皮處理，通過研究不同溫度及培養基對黃花棘豆種子發芽率及幼苗生長的影響，篩選最適合黃花棘豆離體種子萌發及種苗生長的條件，為黃花棘豆的開發利用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗所用黃花棘豆種子于2015年、2016年9月采自青海省湟源縣，該縣地理位置N 36°25′42.1″，E 101°14′02.3″，海拔3 358 m，采后自然陰干，隨機挑選籽粒飽滿的種子4℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子帶菌率的檢測 將種子在5% NaOH中浸泡過夜，用蒸餾水緩慢沖洗1 min，加入20～30 mL乳油-苯胺藍溶液染色，在水浴中沸煮3～5 min，以保證其充分染色，再用自來水沖洗3次，然后取1粒種子放在載玻片上，用撥針挑取種皮，加1～2滴染色液，蓋上蓋玻片在電鏡下檢測并統計種皮和糊粉層中內生真菌的帶菌率[14]。

1.2.2 種子預處理 將黃花棘豆種子先用98%濃硫酸溶液浸泡10 min，無菌水清洗3～5次，70%酒精消毒30 s，再用5.4%次氯酸鈉溶液消毒20 min，最后用無菌水清洗3～5次。將消毒的種子進行剝皮，在無菌水中浸泡24 h后，進行種子發芽試驗[13]。

1.2.3 不同溫度對黃花棘豆種子發芽及幼苗的影響 將預處理好的種子置于MS平板培養基上，分別放入10、15、20、25、30、35和40℃等7個溫度梯度的人工氣候箱中，進行種子發芽試驗，每個溫度下設10個重復，每個重復10粒種子，培養5 d后統計種子發芽率，種子發芽以胚根長等于種子長一半或芽長等于種子長即為發芽，并于試驗的15 d后用直尺測定幼苗的長度、根長以及兩子葉間寬度。

種子發芽率(%)=發芽種子數/總種子數×100%

1.2.4 不同培養基對黃花棘豆種子萌發及幼苗的影響 選用MS、SH、N6、White、LS、MT、B5等7種培養基[15]，將預處理的種子分別置于培養基上，放入相對濕度為85%，16 h光照/8 h黑暗，溫度為25℃的人工氣候箱中，進行種子發芽及幼苗生長最佳培養基的篩選。每個培養基下設10個重復，每個重復10粒種子，培養5 d后統計種子發芽率，15 d后用直尺測量幼苗的長度、根長以及兩子葉間寬度。

1.3 數據統計與處理

所有數據釆用Excel軟件進行數據整理，運用SPSS 22.0分析軟件對所測數據進行各指標的顯著性差異分析，同時通過對各培養基的因子分析確定主成分，并計算各主成分得分，再利用綜合得分公式求出各培養基綜合分值，進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 種子帶菌率的檢測

通過檢測黃花棘豆種子中種帶內生真菌情況，發現黃花棘豆種皮帶菌率達98%，種胚帶菌率為0(見圖1)。

2.2 不同溫度對黃花棘豆種子萌發及幼苗的生長影響

隨著培養溫度的變化，黃花棘豆種子發芽率變化明顯，培養溫度為25℃時，黃花棘豆種子發芽率最高(94.72%)。培養溫度在10～25℃時，隨著溫度的升高，種子發芽率也逐漸升高，當培養溫度繼續升高時，種子發芽率呈下降趨勢。方差分析顯示，黃花棘豆種子在培養溫度為10℃時，種子發芽率顯著低于其他溫度(P<0.05)，15～40℃種子發芽率差異不顯著，但總體呈先上升后下降趨勢(表1)。

表1 溫度處理下黃花棘豆種子的發芽率

通過測定黃花棘豆幼苗的長度、根長以及兩子葉間寬度得到幼苗莖葉長、根長以及兩子葉間寬度在10～40℃時變化均呈先上升后下降趨勢，當培養溫度為30℃時，幼苗莖葉長、根長以及兩子葉間寬度均達到最大值，且莖葉長顯著高于其他溫度處理(P<0.05)，其次為25℃，幼苗根長和兩子葉間寬度在20～30℃時差異不顯著。結合圖3分析，黃花棘豆種子在25～30℃生長明顯，35℃之后種子出現畸形，因此，種子萌發的最適溫度在25～30℃。

2.3 不同培養基對黃花棘豆種子萌發及幼苗的影響

7種培養基對黃花棘豆種子發芽率的影響有差異，其中，發芽率最高的是N6培養基，顯著高于SH、White，LS和B5培養基(P<0.05)，其次為MS、MT，但這3種培養基差異不顯著。通過測定黃花棘豆幼苗的長度、根長以及兩子葉間寬度(圖5)得到，兩子葉寬度最大的是LS培養基，顯著高于其他培養基(P<0.05)；幼苗長度最長的是White培養基，其次為SH和N6；幼苗根長最佳培養基為MT，其次為White，LS和SH培養基，根長最短的是B5培養基。根據不同培養基對種子發芽率、兩子葉寬、莖葉長以及根長的影響，通過主成分分析可得，黃花棘豆種子萌發及幼苗生長最佳培養基為MT培養基(表2)。通過圖6觀察可知，幼苗在各種培養基上的生長狀況也不相同，在B5上生長最差，并出現畸形。在MT，White和N6培養基上幼苗根生長良好，但地上部分生長明顯較弱，MS，SH和LS培養基上幼苗生長良好。

圖1 黃花棘豆種皮及糊粉層帶菌狀況Fig.1 Seed coat and aleurone layer with endophytic fungi of Oxytropis ochrocephala

圖2 不同溫度處理下黃花棘豆幼苗長度、根長及兩子葉間寬Fig.2 Effects of temperature on length，root length and width between two cotyledons of seedling

圖3 不同溫度處理下黃花棘豆幼苗的生長情況Fig.3 Effects of temperature on the seedling

圖4 不同培養基處理下黃花棘豆種子的發芽率Fig.4 Effect of different media on seed germination rate of Oxytropis ochrocephala

圖5 不同培養基處理下黃花棘豆幼苗長度、根長及兩子葉間寬Fig.5 Effects of different media on length，root length and width between two cotyledons of seedling

圖6 不同培養基處理下的黃花棘豆幼苗Fig.6 Effects of different media on seedling

序號培養基F1F2F排序1SH-0.107-0.799-0.34452N60.9020.5760.79023White-0.205-1.955-0.80564LS0.9010.3540.71435MT1.4500.3981.08916B5-2.8130.641-1.62977MS-0.1280.7860.1864

3 討論

近年來，國內外對于黃花棘豆的研究主要集中在黃花棘豆的中毒調查[16]、對放牧家畜的危害[17-18]、有毒成分的研究[19-20]及營養成分分析等方面[6]，對于黃花棘豆種子的研究，也主要集中在種子化學成分分析[21]、種子休眠破除方法以及光照、恒溫及變溫對種子發芽率的影響[22-25]，但對黃花棘豆的開發利用研究相對較少。由于黃花棘豆種皮的內皮層及糊粉層分布著內生真菌，經檢測其帶菌率為98%，但種胚內的帶菌率為0，所以通過物理方法將黃花棘豆種皮剝除，用黃花棘豆種胚進行試驗，目的是獲得無毒的黃花棘豆幼苗，并設置不同溫度及不同培養基進行黃花棘豆組織培養過程中種子萌發階段的最佳條件篩選，試驗結果表明黃花棘豆種子萌發的最佳溫度為25℃，幼苗生長的較適溫度為25～30℃，這與陳超等[25]、趙清梅等[26]研究在溫度為25℃時黃花棘豆種子發芽率最高的結果一致，說明不論直接用培養皿里放入滅菌濾紙還是用組織培養的方式對黃花棘豆種子進行發芽試驗，黃花棘豆的種子發芽的最適溫度均為25℃。但該結果與陸家芬等[23]的研究結果15～20℃為黃花棘豆的適宜發芽溫度，且溫度為25℃時，種子霉變率較高不同，這可能是由于消毒不徹底，種子發芽前處理不同以及采取的發芽方式不同導致。

試驗結果表明，7種培養基對黃花棘豆種子發芽率的影響差異明顯，其中發芽率最高的是N6培養基，顯著高于SH，White，LS和B5培養基(P<0.05)，其次為MS、MT，通過測定黃花棘豆幼苗的長度、根長得到，幼苗長度最長的是White培養基，其次為SH和N6；幼苗根長最佳培養基為MT，其次為White，LS和SH培養基，根長最短的是B5培養基，試驗經過主成分分析得到黃花棘豆種子萌發及幼苗生長最佳培養基為MT培養基。自1937年White建立第一個植物組織培養基以來，許多研究者報道了各種培養基，其數量多，配方各異，目前常用的植物組織培養基有MS、White、B5、N6、Nitsh、Miller、SH、LS等，其中White培養基主要用于生根培養；N6主要為水稻等禾谷類作物花藥培養設計；B5主要特點是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫銨素，適合于某些雙子葉植物特別是木本植物的生長；SH在不少單子葉和雙子葉植物上使用，效果很好；MS是目前最為廣泛的一種培養基，能夠滿足組織對營養元素的需求，有加速養物生長的作用[15]。在試驗中雖然經過主成分分析得到黃花棘豆種子萌發及幼苗生長最佳培養基為MT培養基，但經過對比培養基配方，MT除了有機物部分比MS含量增加，其他成分均相同，再結合幼苗生長情況，MT培養基上的幼苗地上部分比MS培養基生長弱。另外，雖然N6培養基的種子發芽率最高，但是N6上幼苗生長較弱，因此，為了給黃花棘豆無毒株系提供優良的組織培養種苗，最終將黃花棘豆的最佳組織培養培養基確定為MS培養基。

4 結論

通過比較不同培養溫度及不同培養基下黃花棘豆種子發芽及幼苗生長狀況，隨著培養溫度的變化，黃花棘豆種子發芽率變化明顯，25℃下種子發芽率最高，為94.72%，當培養溫度為30℃時，幼苗莖葉長、根長以及兩子葉間寬度均達到最大值，且在10～40℃種子發芽率、幼苗莖葉長、根長及兩子葉間寬度均呈先上升后下降趨勢。7種培養基中發芽率最高的是N6培養基，通過主成分分析得到黃花棘豆種子萌發及幼苗生長最佳培養基為MT培養基，但經過對比培養基配方，將最終培養基確定為MS培養基。