鋁脅迫下檸檬酸對多年生黑麥草種子萌發和幼苗生理特性的影響

黃玉婷，王棟麟，張衛紅，劉大林

(揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

鋁在土壤中主要以氧化物或硅酸鹽沉淀物等形式存在，對植物和環境無毒害作用，但當土壤變為酸性甚至pH<5時，結合態的鋁變為離子態，對植物產生毒害[1]。而環境的破壞導致酸雨頻繁發生，加劇土壤酸化程度，土壤中Al3+的釋放量增多，嚴重影響草本植物的生長。研究表明，鋁脅迫對植物農藝性狀及抗氧化酶系統等均有抑制作用[2-3]。目前，植物耐鋁機制研究已取得一定的進展，其中鋁脅迫導致根系分泌大量有機酸，并與鋁螯合，緩解了鋁對植物根系的毒害作用，減少了根系對Al3+的吸收，其中檸檬酸與Al3+結合程度最高[4]，因而檸檬酸成為緩解植物鋁毒的一個重要物質。黃凱豐等[5]研究表明，檸檬酸處理在一定程度上能緩解鋁脅迫對苦蕎造成的傷害。金婷婷等[6]對大豆的研究表明，添加一定濃度的檸檬酸能緩解鋁脅迫對大豆的毒害作用。但關于鋁脅迫下，添加檸檬酸對禾本科植物特別是黑麥草生長影響的研究較少。

多年生黑麥草(Loliumperenne)是我國南方應用廣泛的禾本科牧草，具有抗性強、再生性強和不易倒伏等優點，還因其營養價值高、適口性好以及生物產量高等特點成為草食畜禽的優質青飼料[7]。此外，黑麥草對土壤中多種重金屬有較強的富集能力[8]，而輕金屬鋁脅迫對黑麥草的影響研究較少。因此，研究不同濃度的檸檬酸對鋁脅迫下多年生黑麥草的種子萌發和幼苗生理特性的影響，以期為緩解酸性土壤中鋁脅迫對植物的毒害作用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

多年生黑麥草品種維多利亞，購于河南世紀天緣生態科技有限公司；試驗試劑為氯化鋁(AlCl3)、檸檬酸(C6H8O7)、1/2Hoagland營養液。

1.2 試驗方法

材料培養采用培養皿濾紙發芽法[9]。挑選形態飽滿均勻的維多利亞種子，用0.2%次氯酸鈉溶液消毒15 min，用蒸餾水反復沖洗4～5次，在水溫為(25±2)℃條件下浸種30 min。設18個處理組，每個處理組重復3次：(1)不加鋁不加檸檬酸(對照)，Al0N0(CK)；(2)加鋁不加檸檬酸，鋁的處理分別為250，500 mg/L，2個濃度等級，代號依次為Al250N0，Al500N0；(3)加檸檬酸不加鋁，檸檬酸的處理 0.2，0.5，0.8，1.1，1.5 mmol/L，5個濃度等級，代號依次為Al0N0.2，Al0N0.5，Al0N0.8，Al0N1.1，Al0N1.5；(4)加鋁加檸檬酸，代號依次為Al250N0.2、Al250N0.5、Al250N0.8、Al250N1.1、Al250N1.5、Al500N0.2、Al500N0.5、Al500N0.8、Al500N1.1、Al500N1.5。在培養皿(直徑10 mm)底部放入雙層濾紙，每個培養皿放60粒種子，分別加入處理液10 mL，每天補充等量蒸餾水。第5 d換培養皿，在新培養皿底部放入雙層濾紙，將幼苗移栽進去，分別加入處理液10 mL，每天補充等量蒸餾水。

1.3 測定指標

1.3.1 生長指標 種子放入培養皿中發芽開始，每天定時觀察種子發芽和幼苗生長的情況，并記錄每天發芽的種子數(胚根長等于種子長度一半)，發芽率按第9 d計算。

發芽勢(GP)=前4 d發芽種子總數/供試種子數×100%

發芽率(GR)=試驗結束時(9 d)種子發芽總數/供試種子數×100%

發芽指數(GI)=ΣGt/Dt

式中：Gt為t日的發芽數，Dt為相應的試驗天數。

株高的測定：種子放入培養皿中發芽開始，第10 d各個處理隨機取5株完整的黑麥草，用直尺測定植株基部到頂部的距離作為株高，每個處理3次重復。

根長的測定：種子放入培養皿中發芽開始，第10 d各個處理隨機取5株完整的黑麥草，用直尺測定胚軸與根之間的過渡點開始到根末端的長度，每個處理3次重復。

1.3.2 生理指標 種子放入培養皿培養10 d后分別測定葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性、葉片丙二醛(MDA)含量和葉片相對電導率。SOD活性測定采用比色法[10]；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[10]；葉片相對電導率采用浸泡法[11]，用DDS-11A型電導率儀測定。

1.4 數據處理

用Excel 2016輸入數據并計算基礎數據，然后用SPSS 18.0進行Duncan法單因素方差分析和多重比較，最后用Excel 2016進行作圖。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸對鋁脅迫下多年生黑麥草的生長特性

2.1.1 種子萌發 與無檸檬酸處理相比，不進行鋁處理以及500 mg/L的鋁濃度處理下，檸檬酸處理對黑麥草的發芽勢、發芽率及發芽指數無顯著(P<0.05)影響，甚至還有抑制作用；250 mg/L的鋁濃度處理下，Al250N0.8處理組提高了黑麥草種子發芽勢、發芽率及發芽指數，分別為83.89%，91.11%和63.10%。但差異不顯著(P<0.05)。檸檬酸對鋁脅迫下多年生黑麥草種子萌發并無顯著(P<0.05)促進作用(表1)。

表1 不同濃度檸檬酸對鋁脅迫下多年生黑麥草種子萌發的影響

注：不同小寫字母表示該品種在相同濃度Al3+、不同濃度檸檬酸處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.1.2 幼苗根長和株高 與無檸檬酸處理相比，單檸檬酸處理對黑麥草幼苗地下部分生長無明顯效應(P<0.05)；250 mg/L的鋁濃度處理下，添加檸檬酸提高了黑麥草幼苗的根長，其中，Al250N0.8處理能顯著(P<0.05)促進其根長；500 mg/L的鋁濃度處理下，添加不同濃度的檸檬酸均能促進黑麥草幼苗的根長，其中Al500N0.8和Al500N1.1處理能顯著(P<0.05)促進其根長，且2種鋁濃度處理下根長隨著檸檬酸濃度的升高先升后降。可見檸檬酸處理對鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗的根長具有顯著促進作用。

與無檸檬酸處理相比，單檸檬酸處理對黑麥草幼苗地上部分的生長沒有顯著(P<0.05)影響；250、500 mg/L的鋁濃度處理下，檸檬酸處理能提高黑麥草幼苗的株高，但差異不顯著(P<0.05)。可見檸檬酸處理在一定程度上能緩解鋁脅迫對多年生黑麥草幼苗地上部分生長的抑制作用(圖1，2)。

圖1 不同濃度檸檬酸處理的鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗的根長Fig.1 Effects of different concentrations of citric acid on root length of seedling under aluminum stress

圖2 不同濃度檸檬酸處理的鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗的株高Fig.2 Effects of different concentrations of citric acid on plant height of seedling under aluminum stress

2.2 檸檬酸對鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片生理特性的影響

2.2.1 葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性 與無檸檬酸處理相比，不進行鋁處理以及250 mg/L的鋁濃度處理下，檸檬酸處理提高了黑麥草幼苗葉片SOD活性，但差異不顯著(P<0.05)；500 mg/L的鋁濃度處理下，檸檬酸處理提高了黑麥草幼苗葉片SOD活性，其中Al500N0.2和Al500N1.1處理SOD活性顯著(P<0.05)高于CK。由此可見，檸檬酸處理能提高鋁脅迫下黑麥草幼苗葉片SOD活性(圖3)。

圖3 不同濃度檸檬酸對鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片SOD的活性Fig.3 Effects of different concentrations of citric acid on SOD activity in leaf of seedling under aluminum stress

2.2.2 葉片丙二醛(MDA)含量 與無檸檬酸處理相比，不進行鋁處理以及250、500 mg/L的鋁脅迫下，添加檸檬酸后，黑麥草幼苗葉片MDA含量有所降低，且隨著檸檬酸濃度升高，MDA含量呈現先降后升的趨勢。其中250 mg/L的鋁濃度處理下，5個檸檬酸濃度處理組MDA含量均顯著(P<0.05)降低，Al250N1.1處理下MDA含量達到最低值。可見檸檬酸處理降低了黑麥草幼苗葉片的MDA含量(圖4)。

2.2.3 葉片相對電導率 與無檸檬酸處理相比，單一檸檬酸處理均能降低黑麥草幼苗葉片相對電導率，其中Al0N0.5處理下相對電導率最低；250 mg/L的鋁濃度處理下，Al250N0.5、Al250N0.8、Al250N1.1、Al250N1.5處理能降低黑麥草幼苗葉片相對電導率，其中Al250N0.8處理組的相對電導率最低；500 mg/L的鋁濃度處理下，Al500N0.5、Al500N0.8、Al500N1.1處理均能降低黑麥草幼苗葉片相對電導率，其中Al500N0.8處理組的相對電導率最低；但各處理均不顯著(P<0.05)。由此可知添加檸檬酸能降低黑麥草幼苗葉片相對電導率(圖5)。

圖4 不同濃度檸檬酸處理的鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片的MDA含量Fig.4 Effects of different concentrations of citric acid on MDA content in leaf of seedling under aluminum stress

圖5 不同濃度檸檬酸處理的鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片的相對電導率Fig.5 Effects of different concentrations of citric acid on relative conductivity in leaf of seedling under aluminum stress

3 討論

檸檬酸具有調節pH值的作用，而pH值的改變能夠破壞胚細胞的結構[12]，抑制酶活性。試驗表明，檸檬酸對鋁脅迫下多年生黑麥草種子萌發(發芽勢、發芽率及發芽指數)無顯著(P>0.05)促進作用，該結果與于敏等[13]添加檸檬酸對水稻銅毒害的研究以及邢素芝等[14]添加檸檬酸對小白菜種子萌發的研究結果相似。其結果可能是由于種子內保護酶系統遭到破壞，其作用機理還有待進一步研究。

鋁毒主要通過抑制主根和側根的伸長進而影響植株生物量。鋁在根尖細胞壁上的積累是鋁對植物根尖產生鋁毒的先決條件，是植物鋁毒敏感的主要特征，Al3+能通過離子交換的形式結合到細胞壁[15]，迫使K+外流[16]，導致細胞壁變薄。初曉輝等[17]對多花黑麥草的研究表明高濃度鋁脅迫下，多花黑麥草的根長顯著下降(P<0.05)。試驗中鋁脅迫均不同程度地抑制了多年生黑麥草幼苗根系的生長，添加檸檬酸后幼苗根系顯著增長(P<0.05)，因此，添加外源檸檬酸對鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗的根長具有促進作用，該結果與徐芬芬[18]對大豆的研究結果相似。Al250N0.8，Al500N0.8和Al500N1.1處理組的緩解效果最為顯著(P<0.05)，因此，不同濃度的鋁脅迫下，緩解效果最佳的檸檬酸濃度基本一致。此外，鋁毒也會抑制植物地上部分的生長，蕭鳳迴等[19]研究證明，鋁脅迫下綠豆的株高降低，總生物量減少。試驗中，檸檬酸處理在一定程度上增加了鋁脅迫下幼苗的株高，孫遠秀等[20]對西瓜幼苗的研究也獲得類似的結果。但是，試驗中檸檬酸對地上部分的緩解作用并不顯著，可能是因為根系吸收的鋁大部分殘留在根系組織中，極少數運輸至地上部分[21]，導致Al3+對地上部分的毒害較輕。有研究報道，檸檬酸處理對植物根系影響較大，而對地上部分影響較小，這可能是種子在萌發期間由胚乳提供能量，在胚乳的能量消耗完后幼苗開始由根部向外界汲取生長所需能量，當用檸檬酸處理時，根系首先受到影響且影響程度比其他部分更加顯著[22]。

SOD是植物體內重要的抗氧化酶，它能維持活性氧的產生和清除平衡，保護植物細胞免受傷害，有研究報道低鋁脅迫會刺激植物SOD活性升高[23]，但隨著鋁濃度升高，SOD活性下降[24]。陳佳等[25]對栝樓的研究發現，添加檸檬酸能明顯緩解鋁脅迫對栝樓葉片SOD活性的抑制作用，試驗表明檸檬酸處理后，鋁脅迫下黑麥草幼苗葉片SOD活性提高，不同檸檬酸濃度產生的效果有所差異，鋁濃度越高，適宜的檸檬酸濃度越低，可能是植物受到鋁脅迫時，根系自身會分泌檸檬酸所致，其原因還有待進一步研究。

MDA和相對電導率都是膜脂過氧化指標。MDA是膜脂過氧化的最終產物，大量積累會損傷質膜，使其選擇透過性變差，導致細胞內電解質外滲，破壞相對穩定的細胞內環境[26]。曹林等[27]報道，鋁脅迫導致菊芋MDA含量增加。而添加檸檬酸能降低葉片MDA含量[28]，修復植物細胞膜系統。相對電導率可反應細胞膜脂過氧化程度，是研究植物抗逆性的重要生理指標，鋁脅迫導致細胞膜結構破壞、穩定性下降，透性增大[29]，最終迫使植物葉片相對電導率上升[30]。試驗結果表明，檸檬酸能降低鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片MDA含量和相對電導率，且隨著檸檬酸濃度升高，MDA含量和相對電導率呈現先降后升的趨勢。在鋁濃度為250 mg/L時添加不同濃度的檸檬酸都能使MDA含量顯著下降(P<0.05)，添加0.8 mmol/L檸檬酸能使相對電導率下降到最低，膜脂過氧化程度相對最輕。因此，檸檬酸處理能使鋁脅迫下幼苗葉片細胞膜傷害的程度得到緩解。

4 結論

鋁脅迫下，檸檬酸處理對多年生黑麥草種子萌發無促進作用，說明檸檬酸不能緩解鋁脅迫對多年生黑麥草種子萌發的毒害作用。此外，通過對鋁脅迫下多年生黑麥草幼苗在檸檬酸處理后的2個形態指標以及3個生理指標進行分析對比，得出添加檸檬酸能不同程度地緩解鋁脅迫對多年生黑麥草幼苗的毒害作用，但不同濃度的鋁毒作用下，不同濃度的檸檬酸對其生長的緩解效果不同。分析認為，檸檬酸濃度為0.8 mmol/L時對鋁脅迫下多年生黑麥草品種維多利亞的生長最有益。因此，添加檸檬酸可以有效緩解酸性土壤中Al3+對多年生黑麥草的毒害作用。