DHX9與惡性腫瘤的治療

馬娟 趙楠楠 楊拴盈

西安交通大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科710000

惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康及社會發展的主要疾病。據2013年中國惡性腫瘤發病和死亡分析估計,全國2013年新發惡性腫瘤病例約368.2萬例,死亡病例222.9萬例,惡性腫瘤死亡率約163.83/10 萬[1]。肺癌、胃癌、肝癌、結直腸癌、女性乳腺癌、食管癌是我國主要的惡性腫瘤,約占全部腫瘤新發病例的66%。肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、結直腸癌是主要的腫瘤死因,約占全部腫瘤死亡病例的70%[1]。在臨床工作中,惡性腫瘤治療仍面對著難以早期發現及診斷、抗腫瘤藥物敏感性低及耐藥的嚴峻挑戰,針對新靶點的發現及靶向藥物治療的研究仍需要進一步深入。

DHX9又稱為核DNA解旋酶Ⅱ或RNA 解旋酶A,主要參與RNA 代謝重要步驟,如轉錄、前體m RNA 剪接、翻譯和核糖體生物合成[2-4],對于維持基因組的穩定性也發揮著重要作用[5]。DHX9是解旋酶DEx H-box家族的成員之一,其名源于解旋酶核心結構域中的保守序列Asp-Glu-Ile-His,也是SFⅡ類解旋酶的一部分,主要包含DEx H 解旋酶和DExD 解旋酶[5]。在線蟲[6]、小鼠[7]和果蠅[8]中均發現其同源蛋白。果蠅中的DHX9突變導致雄蠅因不能蛹化而選擇性死亡[9-10]。在限定溫度下,蠕蟲中的DHX9-1突變產生轉錄去沉默,導致生殖細胞增殖缺陷[6]。在原腸胚形成期間,小鼠純合子DHX9基因突變造成早期胚胎的致死[7]。目前,在人類多種惡性腫瘤中均發現DHX9基因的突變和DHX9表達過程中的改變,表明非功能性DHX9蛋白參與惡性腫瘤的轉化[11-12]。

1 DHX9與惡性腫瘤的發生、發展

1.1肺癌 Cao等[13]將正常肺組織與肺癌組織[小細胞肺癌細胞株 H446、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細胞株A549、PC9]的DHX9表達對比結果顯示,DHX9 在肺癌的血清和組織中均存在過表達,特別是在小細胞肺癌中。且在不同臨床分期的患者中：Ⅲ期或Ⅳ期肺癌患者DHX9明顯高于Ⅰ或Ⅱ期肺癌患者,提示DHX9可能與肺癌的惡性程度與擴散相關。這與Wei等[14]的研究結果一致。隨后通過RNA 干擾使A549 細胞株中DHX9表達下調,使用依諾沙星抑制細胞增殖,盡管依諾沙星抑制了NSCLC 細胞的增殖,但當DHX9 被敲除時其抑制作用減弱[13]。這也表明DHX9在肺癌中的過表達可能有助于肺癌的生長,依諾沙星可以有效抑制DHX9的增殖,DHX9 可以用作肺癌診斷的標志物和治療NSCLC的潛在治療靶點。

對77例NSCLC患者的臨床表現與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)表達進行相關性研究發現癌組織中EGFR 表達顯著高于正常肺組織,其中Ⅲ期NSCLC EGFR 受體表達高于于Ⅰ和Ⅱ期[15]。表明EGFR 染色高強度的存在與人類NSCLC的擴散有關,這與以上研究[13-14]中DHX9 在肺癌中的檢測結果一致。而DHX9同時結合EGFR 和細胞周期蛋白啟動子區富含AT的保守序列可以激活EGFR 反應性基因的轉錄[16],且在靶細胞中,細胞核內EGFR 表達與DHX9、cyclinD1 之間存在強烈的正相關[17]。這說明EGFR 與DHX9的相互作用與肺癌,尤其是NSCLC 的擴散密切相關。此外,DHX9 是DNA/RNA 解旋酶Schlafen-11(SLFN11)蛋白質合作伙伴,而SLFN11的沉默與增加鉑化合物耐藥性有關[18]。這與臨床觀察到攜帶SLFN11 高甲基化的NSCLC 患者對順鉑和卡鉑治療的反應較差的結果一致。此研究還發現SLFN11 與DHX9 發生免疫共沉淀,且細胞核中的SLFN11和DHX9蛋白存在部分共定位[18]。證實DHX9的過表達可能與NSCLC對鉑化合物臨床耐藥性有關。

另外,通過27例肺腺癌患者的肺癌組織與其正常組織的外顯子組和信使RNA(m RNA)進行測序,隨后對篩選發現的序列突變及通路失調及與患者腫瘤表型及臨床預后進行比較,發現DHX9突變同時發生在DNA與RNA 中,且這種高頻率突變與細胞通路失調和患者生存高度相關。這也再次提示DHX9可能是肺癌治療的新靶點[18]。DHX9能與泛素結合酶9 相互作用,使DHX9 的N 端發生泛素化[19]。泛素結合酶9過表達能促進肺癌的轉移及侵襲[20],而DHX9在肺癌中過表達可能也有助于肺癌的生長,這說明DHX9與泛素結合酶9相互作用可能協同促進肺癌的擴散與轉移。

1.2乳腺癌 對細胞核內EGFR 表達、DHX9、細胞周期蛋白D1在51個人乳腺腫瘤樣品中的表達分析,結果發現核EGFR 的表達水平與核DHX9 表達水平強烈相關。此外,核內EGFR 和DHX9的表達與細胞周期蛋白D1的表達呈正相關。這說明核內EGFR/DHX9復合體調控癌細胞中細胞周期蛋白D1 基因的表達。由此也可以預想DHX9與EGFR 的相互作用促進乳腺癌細胞的增殖。目前針對EGFR 的療法,包括吉非替尼、西妥昔單抗、拉帕替尼等在乳腺癌中的臨床效果欠佳。DHX9能否作為乳腺癌治療的潛在靶點還需進一步深入研究[17]。

另外,Schlegel等[21]利用顯性負性方法來阻斷人乳腺上皮細胞中的BRCA1功能并鑒定出BRCA1功能喪失后人乳腺上皮細胞發生的變化。研究結果顯示發現在人乳腺上皮細胞株MCF-10A 中,觀察到DN-RHA 的過表達導致MCF-10A 細胞中四倍體的出現(與乳腺癌早期病變一致)。這說明DHX9高表達可能與早期乳腺癌的發生密切相關。對來自高風險但BRCA1/BRCA2表達陰性的法國、加拿大家庭的96例乳腺癌個體隊列中的BRCA1相互作用蛋白的基因進行檢測發現DHX9基因序列的突變[11]。DHX9可使BCRA1轉錄減少以促進乳腺癌的發生[22]。

1.3尤文肉瘤(Ewing sarcoma,ES) 85%的ES 中存在EWS-FLI1[23]。通過研究EWS-FLI1 對RHA 解旋酶活性的影響,發現EWS-FLI1 以劑量依賴性方式降低RHA解旋酶活性而不影響內源性ATP 酶活動;YK-4-279 抑制RHA 與EWS-FLI1結合并且改變了2種蛋白的RNA 結合特征;而使用YK-4-279的對映異構體[YK-4-279(S)],可以逆轉這種抑制作用。從而得出結論,EWS-FLI1 調節RHA 解旋酶活性,導致整體轉錄組加工的變化[24]。此結果與其他研究結果一致[25],所以DHX9 與致癌轉錄因子EWS-FLI1相互作用促進ES發生。

Fidaleo等[26]發現紫外線照射可以誘導DHX9 亞型的產生,從而導致前體m RNA 的選擇性剪接,進而造成DHX9蛋白的低表達;DHX9 蛋白與RNA 聚合酶Ⅱ和EWS-FLI1形成復合物以增強轉錄。ES細胞中DHX9的沉默使它們對紫外線處理敏感并且影響EWS-FLI1募集到靶基因,而DHX9過表達保護ES 細胞免受基因毒性應激。證實DHX9與EWS-FLI1相互作用,造成ES的發生,抑制DHX9可能為ES的治療提供新的方法和前景。

1.4膀胱癌 人類DHX9 基因定位于前列腺癌的主要易感性位點染色體帶1q25[27],DHX9表達受轉錄因子SOX4控制,SOX4在前列腺癌中過表達[28]。SOX4 與抑制性蛋白質相互作用,導致DHX9 表達降低[29]。SOX4 還調節RNA 誘導沉默復合體中Dicer和Argonaute蛋白的轉錄,兩者都與DHX9相互作用[28-30],事實上,DICER 本身在前列腺癌中過表達[31]。這些研究表明,DHX9可能在前列腺癌發展中發揮作用,但需要進一步驗證其直接聯系。

1.5淋巴瘤 DHX9抑制通過激活p53信號引發凋亡或衰老反應。但也研究顯示DHX9 抑制也可能在缺乏功能性p53的細胞中具有有害作用。DHX9的缺失導致p53 缺陷小鼠淋巴瘤細胞死亡增加,并且p53缺陷型小鼠胚胎成纖維細胞中的G0/G1細胞周期停滯。對p53 轉錄靶標的m RNA 水平的分析表明p53缺失型淋巴瘤盡管沒有功能性p53,p53靶標子集也被激活。這意味著在p53 缺陷細胞中,DHX9通過旁路途徑介導細胞死亡和細胞周期停滯,并支持在p53缺陷腫瘤中靶向DHX9治療的可行性[32]。此外在另一研究中指出無論在體內還是體外情況下,抑制DHX9的表達均對Tsc2+/Eu-Myc淋巴瘤細胞具有致死作用,且可以在體內延長淋巴瘤的形成時間[33]。

1.6結直腸癌 在攜帶鼠科CT26結腸癌肝轉移的小鼠中篩選了一個大核酸酶RNA 寡核苷酸文庫,以鑒定可定位于肝內腫瘤沉積物的RNA 適體。結果發現其中一種適體S-1與蛋白質DHX9 特異性結合,且S-1 優先定位于體內癌細胞的細胞核,而DHX9是已知在結腸直腸癌中上調的RNA 解旋酶,因此具有靶向治療的潛力[34]。

1.7神經母細胞瘤 在神經母細胞瘤中,驅動蛋白家族成員1Bβ(kinesin family member1B isoform b,KIF1Bβ)與DHX9相互作用,引起DHX9的核積累,隨后誘導促凋亡XIAP相關因子1,繼而誘導凋亡。在缺乏神經生長因子的細胞凋亡過程,DHX9誘導是必需的。染色體1p36缺失的神經母細胞瘤同時表現出KIF1Bβ表達缺失和DHX9核定位的受損,暗示神經母細胞瘤發病機制與DHX9核活性的喪失有關。KIF1Bβ具有神經母細胞瘤腫瘤抑制特性并可通過激活促凋亡XIAP 相關因子1表達得到增強,而這需要DHX9的誘導凋亡來實現。KIF1Bβ的缺失改變DHX9 的亞細胞定位并減少交感神經元的神經生長因子依賴性,導致神經母細胞的剔除減少,因此可能易于形成腫瘤。有趣的是,在神經母細胞瘤中,DHX9 可能作為保護性因子。這可能與細胞所處的微環境有關,具體機制還有待進一步研究[35]。

1.8其他 DHX9 也涉及骨肉瘤和Wilms腫瘤。骨肉瘤細胞系的基因表達譜顯示出DHX9 的過表達,核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)途徑中的幾個其他基因也被上調。由于DHX9是一種NF-κB的分子伴侶,這支持NF-κB信號轉導在骨肉瘤轉移中的作用[36]。DHX9 與miRNA miR-483-5p協同作用誘導胰島素樣生長因子2 的表達。在Wilms腫瘤和骨肉瘤中miR-483-5p和IGF 都過表達,且在肉瘤細胞和小鼠異種移植細胞中miR-483-5p的異位表達增強了腫瘤發生[37]。另外,DHX9在宮頸癌的發生中也存在重要的作用。lnc-CCDST 的長非編碼RNA 在宮頸癌組織中顯著下調,而DHX9在宮頸癌組織中上調,并促進宮頸癌細胞轉移和血管生成[38]。lnc-CCDST 和DHX9通過泛素蛋白酶體途徑(E3泛素連接酶MDM2)相互作用促進DHX9降解。人乳頭瘤病毒癌基因E6和E7消除了lnc-CCDST 的表達,破壞MDM2 和DHX9 相互作用以及DHX9降解,導致DHX9的增加,從而促進宮頸癌細胞的轉移和血管生成,并鑒定其可以作為人乳頭瘤病毒惡性腫瘤的潛在治療靶標。

2 DHX9與惡性腫瘤治療

ABT-737是B淋巴細胞瘤基因2、B淋巴細胞瘤基因-XL的有效抑制劑[39-40]。使用Arf-/-Eμ-myc/Bcl-2小鼠淋巴瘤細胞(其過度表達外源BCL-2并且對ABT-737有抗性),在利用sh RNA 篩選ABT-737的致敏劑時,發現DHX9作為合成致死劑被擊中。DHX9 抑制通過激活p53,克服了對ABT-737的抗性,最終導致細胞凋亡[41]。因此DHX9可能是抑制ABT-737或其衍生物的候選靶點。在人類多發性骨髓瘤細胞株中,敲除DHX9出現協同增強糖皮質激素地塞米松對骨髓瘤的治療作用[33,42],表明在多發性骨髓瘤中針對DHX9靶向治療的可能性。在來源于不同類型癌癥(包括多發性骨髓瘤、骨肉瘤、乳腺癌、肺癌和宮頸癌)的人類細胞株中,抑制DHX9 可使大多數以上細胞株致死[33]。在MYC驅動的小鼠淋巴瘤模型中,發現無論在體內或者體外抑制DHX9均對淋巴瘤細胞具有致死作用,并延長攜帶這些腫瘤的小鼠的存活時間;在ES家族腫瘤中,將EWS的5'反式激活結構域與轉錄因子FLI1的3'ETS結構域融合,得到融合蛋白EWS-FLI1,EWS-FLI1具有致癌性[43]。在異體移植模型中,阻斷DHX9和EWS-FLI1之間相互作用的小分子(YK-4-279)則會誘導ESFT 細胞凋亡并抑制腫瘤生長。YK-4-279活性已通過藥代動力學研究進行了優化,并開發了口服可用制劑,因此有希望成為臨床開發的候選藥物[44-45]。已經證明,雖然DHX9的喪失在各種人類和小鼠癌細胞中具有致死性,但是在一定條件下的小鼠模型中DHX9抑制在生物水平上可以良好耐受,且攜帶低水平DHX9的小鼠并未表現出明顯的不良反應,甚至在高度增殖的組織如皮膚或腸中也是如此[41]。因此,有理由推斷DHX9抑制在正常組織中可以耐受,DHX9可能作為惡性腫瘤治療的潛在新靶點。但目前靶向作用于DHX9的藥物仍處于基礎研究,尚需要更多的臨床試驗及數據驗證其有效性及安全性。

3 結論與思考

近年來,隨著精準醫學的不斷發展,人類對腫瘤的認識不斷深入,明確基因型與表型的關聯,精確尋找疾病的原因和治療靶點,根據分子亞型將治療靶點與特定的靶向藥物精準配對,從而實現腫瘤個體化治療[46]。而臨床中腫瘤靶向藥物耐藥普遍存在,目前仍需要更多的研究以制定針對其耐藥可選用的臨床新策略。研究表明DHX9與乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發生密切相關,可能成為惡性腫瘤治療的新靶點。

DHX9在DNA復制、轉錄、翻譯,RNA 加工及轉錄,維持基因穩定性等方面具有重要的調控作用。在多種人惡性腫瘤中均存在DHX9的過表達,抑制DHX9會對大多數腫瘤細胞具有致死性,但在腫瘤細胞和正常組織中,DHX9抑制的不同作用及機制仍不清楚,可能與DHX9對腫瘤細胞的更高依賴性有關。鑒于DHX9在DNA/RNA 復制、轉錄、翻譯、維持基因穩定性過程均有重要的作用,而腫瘤細胞中上述過程大多失調,那么腫瘤細胞對DHX9是否具有“依賴性”也值得深思及進一步深入研究。另外,在神經母細胞瘤中,DHX9可能抑制腫瘤的發生,這暗示DHX9的作用可能與細胞所處的微環境及相互作用的分子伴侶活性相關。在人體中,DHX9抑制劑又是否存在“脫靶”及對機體不良反應的大小還有待進一步的大量多中心臨床試驗驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突