慢性阻塞性肺疾病不同種類標本的蛋白質組學研究

帥迪全 王筠 李水明 陳成水 金美玲 盛司潼

1深圳大學生命與海洋科學學院518055;2溫州醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科325000;3復旦大學附屬中山醫院呼吸科,上海200032

最新流行病學調查(2018年)結果顯示,目前我國COPD患病總人數高達9 990萬,約占全球患者的1/4,而40歲以上人群的患病率達13.7%,給社會和家庭帶來了沉重的負擔[1]。若無進行早期針對性治療,患者氣流受限會逐步加重并呈不可逆改變,因此,COPD致殘率及致死率均較高。當前,COPD在全球致死性疾病中已排名第四。據統計學預計,到2020年該病將上升為第三大死因,是人類健康衛生面臨的一個嚴峻問題[2]。

COPD是遺傳和環境交互作用的復雜疾病,已公認的高風險因素有：香煙煙霧和生物燃料中所含的有害顆粒與氣體,它們可導致呼吸系統發生不同程度的炎癥反應和組織損傷[3]。近年來,國內很多地區PM2.5(空氣動力學直徑≤2.5μm 的顆粒物)污染嚴重,也可致成人的呼吸系統受損[4]。但是,它能否成為COPD的一個高風險因素,仍有待于研究確認。

高通量檢測技術和生物信息分析技術的快速進步,極大地推動了COPD蛋白質組學的研究進展,特別是對新的多肽/蛋白質靶標的深度挖掘,有助于發現新的風險因子,科學評估環境因素的影響、調控發病機制以及進行個性化診治。

1 蛋白質組學及相關技術

1994年,Wilkins和Williams首次提出蛋白質組的概念[5],其定義為“一種細胞/組織的基因組所表達的全部蛋白質”,可從宏觀與微觀層面上對蛋白質的組成成分、分類鑒定、表達水平、蛋白質翻譯后修飾、以及蛋白質與核酸、蛋白質和代謝產物相互作用等進行全方位的研究。蛋白質組學不僅對蛋白質可進行定性或定量的檢測與差異比較,還可動態分析蛋白質的定位和修飾,以及特定蛋白質與其它蛋白質、核酸、基因等的互作關系,進而揭示特定蛋白質的生物學功能,以及其與疾病發生、發展的關聯性[6-7]。

蛋白質組學技術目前是由蛋白質分離技術、蛋白質鑒定技術、生物信息學分析技術和蛋白質驗證技術組成。(1)蛋白質分離技術：包括樣品總蛋白質的提取制備、雙向凝膠電泳分離、比較差異蛋白質以及高效液相層析定性/定量讀取單一多肽并拼接等技術;(2)蛋白質鑒定技術：主要運用質譜技術快速鑒定和高效篩選,包括雙向凝膠電泳質譜技術、表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜、基質輔助激光解吸離子化飛行時間質譜、電噴霧離子化質譜和液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)等,后者的應用范圍比較廣泛;(3)生物信息學分析技術：可運用pFind、MASCOT和SEQUEST 等多個軟件,在SWISS-PROT、Uniport、NCBI、GenBank和EMBL 等蛋白質數據庫中進行數據檢索,采用Omicsbean、Spectronaut、Skyline、TPP 和Scalffold平臺/軟件對數據進行分析與預測,并對候選蛋白質進行生物過程、細胞成分、分子功能、信號通路和互作關系等進一步的分析與評判;(4)蛋白驗證技術：將經生物信息學技術篩查出的候選蛋白質,進行樣本的可靠性驗證(包括擴大樣本的預測驗證,以及在細胞和動物模型上的功能驗證)。這項技術包括現今運用較廣泛的酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白質免疫印跡(Western blot)、免疫組織化學、SRM/MRM、PRM、 DIA、PCT-SWATH 等。其中PCTSWATH 是Guo等[8]基于DIA 發展的一項新技術,可對大量臨床樣本進行高重復高通量的質譜分析,不僅可以應用于疾病的生物標志物的研究,而且還可以有助于蛋白組學檢測技術推廣應用于臨床檢驗。Kusebauch等[9]使用SRM技術在肝細胞和前列腺癌細胞上進行研究,實現對20 277個注釋的人類蛋白質中的99.7%進行定量檢測,并報告了166 174種蛋白質肽段信息,還以此建立了SRMAtlas數據庫。在疾病的生理和病理研究中,蛋白質及肽段的定量檢測實現了革命性的突破。

近年來,已有不少關于COPD蛋白質組學的研究報道,并發現了一批與病變緊密相關的、具有潛在應用價值的、高靈敏和高特異的候選蛋白質[10]。它們可以彌補現有臨床檢測手段和傳統病理觀察方法的不足。例如：以蛋白質為靶標的臨床檢測,既可減少或避免支氣管鏡檢等創傷性檢查對患者的傷害,還可動態觀察與該病相關的信號通路的網絡調控及疾病的發生、發展。尤其當經過臨床大隊列大樣本群的預測驗證,然后再通過細胞和動物模型的功能驗證,基本可以挖掘出一批新的分子標志物,以用作臨床對COPD的早期診斷與鑒別診斷、新藥研發、療效監控與評估,以及預后判斷等的指導。

2 不同種類COPD標本的蛋白質組學研究

COPD的蛋白質組學研究,可以從患者的血液、支氣管肺泡灌洗液、誘導痰、氣道上皮襯里液、呼出氣冷凝液、肺病變組織、外泌體和其它多種類型的標本中,篩選與該病發生、發展相關的蛋白質標記物,進行定性或定量的檢測與分析,并動態地反映COPD的異質性病灶和不同病期致病性蛋白質的種類和數量的變化[11]。以下著重回顧近年來采用蛋白質組學技術在COPD不同來源的標本中篩查和驗證蛋白質標志物的研究進展。

2.1血液標本 血液標本中的蛋白質檢測與分析在COPD蛋白質組學研究中最為常用。因為外周血標本中含有豐富的、能反映疾病狀態與特征的多種蛋白質,且采集方式只是微小創傷,并可多次重復操作。此類標本在COPD的研究中分為4個亞類：(1)血細胞中的蛋白質;(2)血漿中的蛋白質;(3)血清中的蛋白質;(4)外泌體中的蛋白質。可依據研究需求決定采集哪一類或多類血液標本檢測。篩查和利用血清中的生物標志物,既能更準確地闡述COPD的發病機制和分類,還能有效地開發COPD的特異性療法[12]。但是,在進行血清/血漿蛋白質組學研究中,由于血液中富含多種高豐度的基礎與結構蛋白質,有可能會遮蓋一些低豐度蛋白質的檢測,故需先執行去除高豐度蛋白質這一關鍵步驟。

Okano等[13]采用基于iTRAQ 標記的二維差異凝膠電泳質譜技術,比較11例肺鱗狀細胞癌患者、7例COPD患者和7例健康吸煙者血清中蛋白質表達水平的不同,發現COPD患者血清中AACT 蛋白質水平與健康吸煙者相比是降低的。此結果與另一篇關于COPD發病與AACT 基因的突變和多態性有關的報道一致[13-14]。由此表明,AACT 可作為與COPD發病相關的蛋白質標志物。Bozinovski等[15]使用表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜技術發現血清淀粉樣蛋白A 在急性發作的COPD中呈上調表達,故該蛋白有可能在COPD的急性發病機制中發揮作用。Baralla等[16]采用2-DE聯合基質輔助激光解吸離子化飛行時間質譜技術對43例患有輕中度COPD的患者與43例正常對照受試者的血漿進行比對分析,發現了29個組間表達差異的蛋白質。再經Western blot驗證,證實了抗纖維蛋白原α鏈和維生素D 結合蛋白在COPD呈上調表達,提示它們有可能成為COPD早期監測的生物標記物。Diao等[17]利用iTRAQ 標記的LC-MS/MS 技術,對健康吸煙者和COPD加重期患者的血漿進行比對,共識別出41個顯著差異性表達的蛋白質,其中13 個呈上調表達,28 個呈下調表達。而后經過ELISA 驗證,證實甲狀腺素結合球蛋白在COPD患者血漿中高水平表達,表明它具有該病血漿生物標志物的潛能。Leung 等[18]使用多反應監測質譜法對多隊列COPD加重期和恢復期的患者血漿進行檢測與分析,也發現5個可能成為COPD加重期和恢復期生物標志物的蛋白質(APOA4、CO9、FINC、APOC2、LBP)。

2.2支氣管肺泡灌洗液標本 來源于支氣管肺泡灌洗液的標本含有的蛋白質主要是由血漿滲出的,也可能是由氣道上皮細胞和炎癥細胞脫落或分泌。基于支氣管肺泡灌洗液的COPD蛋白質組學的研究,有助于對COPD發病機制和機體對該病防御反應的深入了解[19]。

Pastor等[20]采用雙向凝膠電泳聯合基質輔助激光解吸離子化飛行時間質譜,比較分析了正常對照組、COPD組、肺癌組和COPD合并肺癌組(各15例)的支氣管肺泡灌洗液樣本。COPD組與正常對照組比較,發現28個表達差異的蛋白質;COPD合并肺癌組與正常對照組比較,發現33個表達差異的蛋白質。這些與COPD疾病相關的蛋白質所涉及的信號通路主要與炎癥、自由基清除、氧化應激反應和糖酵解/糖異生途徑有關。經過Western blot驗證,確認了PRDX1和HSP70 2個蛋白質在COPD患者支氣管肺泡灌洗液呈高表達,表明它們極有可能是潛在的COPD標志物。Tu等[21]運用基于離子電子流的鳥槍法蛋白質組學技術對COPD患者和健康對照者的支氣管肺泡灌洗液樣本進行比對分析,定量獲得423種差異蛋白質,其中76種蛋白質的表達存在顯著性改變。Western blot 法證實其中ADH1B、ALDH3A1、ALDH2、CTSD、FGB、LGALS3、APCS和TAGLN2這8個蛋白在COPD中均高水平表達。結果表明了定量蛋白質組學技術在COPD研究中的可靠性和特異性,也為疾病防治所需的生物標志物研發提供了新途徑和新工具。Yang等[22]采用基于iTRAQ 的鳥槍法蛋白質組學技術對從不吸煙健康者與肺功能正常吸煙者的支氣管肺泡灌洗液的細胞蛋白質進行研究,定量得到了506種差異蛋白質,富集于15條信號通路上。其中在吞噬體和白細胞反式內皮遷移這2條通路中的蛋白質與激活的細胞毒性T 細胞(CD69+)和吸煙者的氣道阻塞水平(第一秒用力呼氣容積與用力肺活量比值)具有顯著相關性,為已公認的COPD發病高風險因子-吸煙相關的分子機制研究提供了新視野。

2.3誘導痰標本 COPD患者的痰液多位于肺泡或小支氣管,不易排出。誘導痰是經吸入高滲鹽水誘導產生的,含有氣道中的炎癥細胞和介質,能在一定程度上反映疾病的表型特征,故可用于篩查COPD特異性蛋白質標記物[23]。

Titz等[24]采用基于Tandem Mass TagTM6-plex標記的LC-MS/MS技術,對無病癥吸煙者、早期COPD的吸煙者、曾吸煙者和從不吸煙者共4組受試者的誘導痰上清液進行比對研究。通過對比COPD患者與無病癥吸煙者,發現了TIMP1、APOA1、LEG1和BPIFB1等13種差異蛋白質,證明經誘導痰的分析可揭示由香煙煙霧暴露引起的COPD病變復雜的生理反應。Gao等[25]采用雙向凝膠電泳質譜技術對不吸煙者、吸煙無COPD者和吸煙伴COPD者3組的誘導痰進行比對研究,發現COPD患者與不吸煙者,或與吸煙無COPD者比較,具有殺菌與通透性作用的含褶皺蛋白B1 的表達水平均上調,并經過 Western blot、ELISA 和免疫組織化學實驗驗證。由此提示,含褶皺蛋白B1可能參與了COPD吸煙者的發病機制。為了探討使用電子煙對氣道的影響,Reidel等[26]采用無標記定量蛋白質組學技術對吸煙者、吸電子煙者和非吸煙者的誘導痰樣品進行比較,共鑒定出大約1 000種蛋白質。與非吸煙者相比,吸電子煙者的誘導痰含有大約81種具有顯著性改變的蛋白質,其中在COPD中起天然防御作用的彈性蛋白酶和基質金屬蛋白酶9呈明顯表達上調。結果警示電子煙可改變氣道分泌物中的天然防護蛋白質,產生與吸香煙類似的變化。說明其作為香煙的替代品,也會對人體組織細胞造成傷害。為了研究氣道中蛋白酶底物和蛋白酶活性與COPD的關聯,Mallia-Milanes等[27]運用基于底物末端胺同位素標記聯用質譜的蛋白質組學技術,檢測了COPD穩定期和加重期的誘導痰樣品,共鑒定出299 種蛋白質,包括蛋白酶、蛋白酶抑制劑、黏蛋白、防御素、補體和其他先天免疫蛋白。再經過Western blot分析表明,COPD加重期的氣道彈性蛋白酶較穩定期的表達呈明顯增加,為COPD有關蛋白酶研究提供了基礎實驗數據。

2.4氣道上皮細胞 氣道上皮細胞由杯狀細胞、纖毛細胞、小顆粒細胞、刷細胞及其他細胞組成,覆蓋在氣道管壁上。氣道上皮細胞被感染或結合某些有害物質(如煙霧、粉塵、大氣污染)后,完整性被破壞,進而誘發COPD等慢性氣道疾病的產生[28]。

Ghosh等[29]采用LC-MS/MS 技術,對不吸煙者、吸煙者和吸電子煙者的氣道上皮細胞進行了分析,鑒定出292 種蛋白質。吸電子煙者對比不吸煙者,CYP1B1、MUC5AC和MUC4的表達水平上升。使用丙二醇/植物甘油單獨霧化人氣道上皮細胞和鼠鼻上皮細胞,再經Western blot驗證,證實了MUC5AC 呈顯著增加,表明它可能是COPD病變的一個潛在標志物。Pang 等[30]采用Label-free LC-MS/MS技術在大鼠氣管上皮細胞、脂多糖處理大鼠氣管上皮細胞和脂多糖與重組CC16 蛋白共處理的大鼠氣管上皮細胞進行研究,鑒定出12種差異蛋白質。這些差異蛋白與細胞增殖、細胞骨架、炎癥、基因調控、藥物代謝及解毒有關。采用反轉錄實時定量聚合酶鏈式反應對11種差異蛋白質對應的mRNA 進行驗證,均有與蛋白質相似的趨勢,揭示了CC16蛋白抗炎作用的分子機制,為COPD等氣道炎癥疾病的研究提供了新思路。

2.5氣道上皮襯里液標本 上皮襯里液是襯在氣道黏膜和肺泡表面上的上皮細胞所產生的液體層,含有分泌的蛋白質,在宿主防御中發揮著重要作用,還能反映如空氣污染物、香煙煙霧的有毒成分和過敏原等外部污染因子,所以這類樣本也可用于COPD蛋白質組學研究[31]。

Franciosi等[32]使用基于iTRAQ 標記的定量蛋白質組學方法對年輕正常對照者和年老COPD患者在抽了3支卷煙后24 h收集的上皮襯里液進行分析,發現吸煙后COPD患者的PRDX1/SERPINB3 和ALDH3A1 均增加。ELISA證實了SERPINB3的變化,免疫組織化學實驗在肺組織上SERPINB3和ALDH3A1 的染色結果也與iTRAQ 數據結果一致,這提示上述2種蛋白在COPD病變中可能參與了分子調控機制。Franciosi等[31]采用基于微流體的nano LCMS/MS技術對COPD患者與健康對照者的上皮襯里液進行了對比研究,共鑒定出193種蛋白質,其中乳轉鐵蛋白、高遷移率族蛋白B1、α1-抗胰凝乳蛋白酶和cofilin-1 在COPD患者上皮襯里液中的表達顯著高于健康對照者。并進一步通過免疫組織化學實驗加以驗證,為利用人氣道上皮襯里液標本進行nano LC-MS/MS研究提供了實驗的可行性和可靠性。

2.6呼出氣冷凝物標本 呼出氣冷凝物是通過無創方法收集的呼出氣冷卻凝固物質,目前呼出氣冷凝物作為尋找COPD呼吸道生物標志物的一種樣品類型已被公認[23]。

López-Sánchez等[33]采用LC-MS/MS,對健康對照、吸煙、COPD和肺癌4組共192個呼出冷凝物樣品進行分析,共鑒定出348種蛋白質,并通過隨機森林算法建立了一個穩定的模型。在模型中通過受試者工作特征曲線分析得出待鑒定蛋白質的信息。COPD中DCD 和HRNR 蛋白質的受試者工作特征曲線下面積＞0.75,具有診斷價值。Kononikhin等[34]采用高效LC-MS/MS,對健康對照、肺炎和COPD3組共79個呼出氣冷凝物樣本進行比較研究,發現PRDX1蛋白質在COPD與對照組比較中呈差異性表達,但尚缺驗證試驗。Fumagalli等[35]采用LC-MS/MS,對20例吸煙者、25例不吸煙者、15 例無肺氣腫的COPD患者及23例α1-抗胰蛋白酶缺乏癥患者的呼出氣冷凝物進行了相關研究,發現與不吸煙對照組相比有17 個蛋白質在COPD組呈特異性差異表達,其中α1-抗胰蛋白酶、鈣粒蛋白A 和B通過表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜和Western blot實驗被驗證有顯著性差異,可成為COPD的診斷標志物。

2.7肺病變組織標本 在疾病的蛋白質組學研究中,病變局部的組織樣本不僅具有較多的疾病特異性蛋白質,且可檢測到原位蛋白質的分布和共定位的形態學信息[36]。Zhu等[37]采用PCT-SWATH 技術在肝癌冷凍組織上進行研究,共鑒定出高置信且高重復2 579個蛋白質、11 787個蛋白質肽段,并用免疫組織化學法驗證了MCM7蛋白質的表達。這證明PCT-SWATH 技術可對冷凍組織樣品進行快速蛋白質組學分析,為輔助臨床醫學診斷提供新途徑。

Ahrman 等[38]采用無標記定量蛋白質組學聯合SWATH-MS分析方法,對COPD肺組織和特發性肺纖維化肺組織進行比較分析后共鑒定出3 369種蛋白質。經免疫組織化學驗證分析發現金屬蛋白酶抑制劑3和基質金屬蛋白酶28這2種蛋白質在COPD患者中的表達明顯高于特發性肺纖維化患者,說明它們可能與COPD的氣道重塑有關。Ohlmeier等[39]采用雙向凝膠電泳質譜技術,對不吸煙者、吸煙者、COPDⅠ～Ⅱ期吸煙者、COPDⅢ～Ⅳ期吸煙者、α-1-抗胰蛋白酶缺乏癥和特發性肺纖維化患者共51例的肺組織進行鑒定,找出159個蛋白質斑點,從屬于82種蛋白質。Western blot分析認為,其中CTSD、DPYSL2、TGM2和TPP1可能是與COPD疾病相關的特異性蛋白質。經ELISA 驗證進一步表明TGM2在COPDⅡ～Ⅲ期患者痰和血漿中的表達水平顯著性升高。因而,TGM2被認為可作為COPD診斷和治療的潛在新靶標。

2.8外泌體標本 外泌體是由機體多類細胞分泌的胞外囊泡(直徑為30～100 nm),內含細胞的代謝產物,也可攜帶疾病的特定分子信息(包括DNA、RNA、蛋白質、脂質和代謝物等各類大小分子),穿梭于細胞間與各種體液中,介導著細胞間的通訊和運輸,并調控靶細胞的功能[40-41]。Zhang等[42]通過不對稱流場分流分離,將外泌體分為40～120 nm 的大外泌體和60～80 nm 的小外泌體。蛋白質組學的分析進一步揭示：小外泌體中含有內體、多泡體、液泡和吞噬囊泡等,為經典的外泌體;大外泌體則含有質膜、細胞連接、次級內體和反式高爾基體網絡等,為非經典的外泌體。這兩種外泌體中均富含大量的蛋白質,在機體的生理與病理過程中發揮著重要的作用,也是疾病液體活檢診治的重要參數,目前日益受到極大的關注。

Gupta等[43]采用無標記定量蛋白質組學技術,對原發性氣管支氣管細胞(human tracheobronchial epithelial cell,HTBE)和培養的氣道上皮細胞系(Calu-3)的分泌物進行了研究。先將HTBE細胞分泌物中分離出的外泌體轉移至Calu-3細胞,再收集其共分泌物;同時,還將Calu-3細胞分泌物中分離出的外泌體轉移至HTBE 細胞,再收集其共分泌物。進而,將這4種分泌物進行了比較蛋白質組學實驗和分析。結果發現HTBE 細胞分泌物中主要含有MUC5B等天然性蛋白質,而Calu-3 細胞分泌物中主要包含MUC5AC等病理性蛋白質。在進行外泌體轉移后,分泌物中大約有20%蛋白質(包括MUC5AC和MUC5B)發生了顯著的變化,這表明氣道上皮細胞間外泌體的轉移可改變黏蛋白的分泌情況。這一機制可能對上皮細胞重塑發揮了作用,為COPD發病機制的研究提供了新思路。

2.9其他 尿液等其他標本在COPD的蛋白質組學研究中也占有一定的地位。Carleo等[44]采用毛細管電泳聯用質譜對COPD含α-1 抗胰蛋白酶(Pi MM)患者和COPD不含α-1抗胰蛋白酶(PiZZ)患者的尿液進行了相關研究,共鑒定出36 種蛋白質。在邏輯回歸模型中COL1A1 和COL5A3的敏感度和特異度較高,可對PiMM 和PiZZ 進行區分。此外,載脂蛋白A-I和C4、視黃醇結合蛋白4和前列腺素-H2D-異構酶在PiZZ患者中呈現低水平表達;雖然凝溶膠蛋白和血紅蛋白α 在PiZZ 患者中表達,但在PiMM 患者中不表達。因此,該研究證實了PiMM 患者和PiZZ患者尿液中蛋白質的含量不同,有望為個性化治療提供實驗數據。但是,尿液標本中蛋白質成分與含量在很大程度上受腎功能(特別是腎小球與腎小管上皮細胞的分泌與吸收功能)影響,故其應用具有相當的局限性。

3 結語

近年來,醫學科學家們利用蛋白質組學的先進檢測技術,對受試者多種類型樣本中的COPD蛋白質標記物進行了較全面的篩查,發現了一大批與病變關系密切的新靶標,后續大量的功能驗證實驗正在逐步展開。另外,如何提高分子標志物的敏感度和特異度,如何擴大與補充樣本庫和數據庫,如何更新和完善數據分析軟件,以及如何推進蛋白質組學的臨床轉化應用等瓶頸問題仍亟待解決。我們認為只有聯合基因組學、轉錄組學、代謝組學、表觀遺傳學、離子組學等多組學技術的應用,才能真正找到特異度更強、敏感度更高、應用性更廣的蛋白質標志物,使它們在COPD疾病的系統性和動態性研究中發揮出更大的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突