調控氣道杯狀細胞分化的抗小兒哮喘藥物研究進展

龔文婷 萬蒞

湖北省婦幼保健院藥劑科,武漢430070

支氣管哮喘(哮喘)是一種發病機制復雜的氣道慢性炎癥性疾病。近年來,其在幼兒群體中,發病率逐年升高,已引起極大的關注[1]。研究表明小兒哮喘涉及多種細胞,尤其與免疫細胞,氣道上皮細胞等細胞之間的互動異常有關,其病理生理特性主要表現為氣道高反應性(airway hyper-responsiveness,AHR)和氣道黏液的異常高分泌[2]。氣道黏液的正常分泌可維持氣道屏障,維持氣道上皮細胞功能正常方面發揮重要作用,但其異常分泌則可能導致哮喘患者氣道阻塞,進而導致氣流受限,引起哮喘患者病情加重,甚至引起死亡[3]。

調控哮喘狀態下的氣道黏液分泌,可能對哮喘的治療具有重要意義,本文主要從與氣道黏液分泌密切相關的氣道上皮細胞分化調控角度[4],分析其可能干預環節,總結調控氣道上皮細胞分化的潛在靶點及藥物,以期為相關藥物的開發提供思路[1,4]。

1 哮喘下的氣道杯狀細胞分化異常

1.1 氣道杯狀細胞的分化 人氣道上皮是保護人體呼吸道免受外部刺激損傷的主要屏障。它主要由三種細胞組成：分別為基底細胞、纖毛細胞和分泌細胞(杯狀細胞和棒狀細胞)。其中杯狀細胞與黏膜下腺體一起分泌MUC5AC 和MUC5B這兩種黏蛋白,進而作為氣道黏液的重要組成部分,維持氣道的正常功能[5]。

氣道杯狀細胞的分化可導致氣道杯狀細胞數目增加,同時可上調黏蛋白,如MUC5AC和MUC5B的上調,進而使氣道中黏液分泌增加,保護機體免受外界病毒、細菌對氣道或肺部的感染[6]。但在某些慢性氣道炎癥狀態下,其氣道杯狀細胞表現為異常分化,進而使黏蛋白異常分泌與積聚,并隨著時間的推移增加感染概率及氣道阻塞[4]。

1.2 哮喘與氣道杯狀細胞分化異常 在幼兒哮喘患者的氣道中,可見平滑肌細胞增生、杯狀細胞增生、黏膜下層腺體增生/肥大、上皮細胞纖維化等細胞異常病變。這種氣道重塑可造成細胞的反復損傷,進而導致吸入更多的過敏原和環境刺激物、感染,進而誘導一系列炎癥和免疫異常應答。其中氣道杯狀細胞分化異常是其中的一個重要病理學改變[4]。

幼兒哮喘患者體內,多見與氣道黏液密切相關的黏蛋白的異常表達。在正常的氣道黏液中,MUC5B 可以線性排列同時通過杯狀細胞分泌的 MUC5AC 進行錨定[6],除這些黏蛋白外,還有鹽、脂蛋白等,其中固體含量約為3%左右。而在哮喘患者的黏液中,其固體比例可達到15%[7]。而固體比例的增加將導致更多的分子間相互作用,并形成更厚、黏性更強的凝膠層。進而進一步的影響哮喘的疾病進程[4,8]。

2 與氣道杯狀細胞分化密切相關的信號通路

氣道杯狀細胞的分化調控與多種信號通路有關,且這些信號通路間還存在著交互調控,目前報道較多的主要有表皮細胞生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR),Th2型細胞因子,Notch 通路,信號轉導與轉錄激活因子6(signal transducers and activators of tranion 6,STAT6)信號通路以及Wnt信號通路[8]。

2.1 EGFR EGFR 是與生長密切相關的多功能受體蛋白,在哮喘模型小鼠的氣道中,可見EGFR 免疫反應性與氣道杯狀細胞的分化增加呈正相關,提示EGFR 參與調控了氣道杯狀細胞的分化。EGFR 信號轉導涉及四種細胞表面受體蛋白(EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3 和 ErbB4)。多種配體如表皮生長因子[6],轉化生長因子α與ErbB受體二聚體結合,后續經歷構象變化,導致激活多種下游蛋白質復合物,包括磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B,絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶等,進而調控氣道穩態。轉化生長因子α和表皮細胞生長因子可由多種炎癥細胞,如嗜酸粒細胞和中性粒細胞分泌。而影響這些炎性細胞,則會使EGFR 信號轉導異常,導致哮喘疾病狀態下的氣道黏液異常分泌[9]。

雖然EGFR 明顯與氣道杯狀細胞分化有關,但靶向EGFR 的治療方法仍面臨巨大挑戰。EGFR 酪氨酸激酶抑制劑BIBW 2948在臨床試驗中未能減少慢性肺阻塞患者氣道黏液量及黏蛋白的表達。后續可重點關注EGFR 下游的信號通路,或通過調控相關信號通路的互動起到相應的治療作用[10]。

2.2 Th2型細胞因子 除EGFR 信號通路外,許多細胞因子,如IL-13、IL-4、IL-5和IL-9等[11],有研究表明IL-13可以在許多物種的氣道上皮細胞中誘導持續性的氣道杯狀細胞分化,這可能與IL-13激活EGFR 信號通路有關,而通過特異性抑制劑拮抗EGFR,可抵消IL-13 誘導的杯狀細胞分化[12]。

此外IL-4和IL-5亦是黏液誘導劑,特別是在哮喘患者中。另外,IL-4與IL-13表現出高度的結構相似性[13],通過相同的受體復合物發出信號并且兩者共享幾種信號轉導途徑。雖然過表達IL-4和IL-5的小鼠都表現出顯著的杯狀細胞分化異常,但這些細胞因子缺乏的小鼠在用腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)進行外源性治療后顯示與對照相似的杯狀細胞分化[11,14]。

2.3 Notch通路 Notch家族由4種(Notch1～4)跨膜受體蛋白組成,與配體結合后,Notch細胞內結構域通過兩次蛋白水解切割釋放事件和轉移到細胞核以打開/關閉關鍵轉錄譜[15]。其中關鍵的轉錄效應子為重組信號結合蛋白-κJ。Notch信號通路可抑制氣道上皮中的多纖毛素蛋白和Forkhead Box J1的表達,進而抑制纖毛細胞的分化[16]。

盡管Notch 與肺上皮細胞命運密切相關,但不同的Notch蛋白異構體引起的轉錄反應效應并不一樣[17]。例如,Notch1和Notch2可激活淋巴增強子結合因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1,LEF-1),而Notch3確不能激活LEF-1[18]。最近,Notch2已經被鑒定為小鼠肺中炎性細胞因子驅動的杯狀細胞化生的關鍵,且在體外分化的人支氣管上皮細胞中也觀察到這種效應。與此發現相反,Notch1或Notch3的過表達已被證明可以驅動在沒有炎性細胞因子如IL-13的系統中的杯狀細胞化生[14,17]。

2.4 STAT6信號通路 STAT6是由IL-13和IL-4選擇性激活的關鍵轉錄因子,其影響多個靶基因的表達,包括激活后參與杯狀細胞分化的部分重要基因[19],因此STAT6是細胞因子信號轉導的中樞介質。STAT6 缺陷小鼠在IL-13暴露后不表現出杯狀細胞的分化,但在STAT6重建后可恢復。STAT6也顯示在哮喘氣道上皮細胞的轉錄起始位點表現出異常的組蛋白乙酰化模式。STAT6 可上調GATA 結合蛋白3表達[20],其與Th2細胞因子和氣道重塑的產生密切相關。有趣的是,盡管STAT6 缺陷型小鼠對IL-13刺激不敏感,但它們仍然能夠在Notch信號通路激活后表現出杯狀細胞分化的異常[4],表明盡管IL-13 介導的杯狀細胞分化除依賴于STAT6外,還涉及IL-13/STAT6的獨立途徑[15]。

2.5 Wnt/β-連環蛋白信號通路 Wnt蛋白及其配體對成人肺部的肺形態發生和組織維持至關重要[14]。Wnt信號轉導通路主要有經典(穩定和β-連環蛋白向細胞核易位)或非經典(β-連環蛋白非依賴)的兩條信號通路。在經典途徑中,Wnt配體用于穩定轉錄共激活因子β-連環蛋白在細胞溶質和核內的穩定表達,進而結合并激活許多下游轉錄因子[8],包括眾所周知的LEF-1 和TCF-1/3/4。這受到Wnt配體與卷曲蛋白受體結合的調節[21]。

β-連環蛋白信號轉導是響應Wnt配體和其他細胞外配體介導氣道上皮細胞中分化和增殖的關鍵。在化學誘導哮喘的甲苯二異氰酸酯模型中,使用端錨聚合酶抑制劑(穩定β-連環蛋白破壞復合物)或使用β-連環蛋白/CBP抑制劑ICG-001進行治療[12],兩種情況下均顯著降低杯狀細胞的分化,表明β-連環蛋白在杯狀細胞分化中的作用可能是刺激特異性的[22]。

2.6 其他相關的信號通路 除了上面列出的信號轉導途徑和細胞因子之外,還有許多新興的候選蛋白和miRNA 也影響氣道上皮細胞內的杯狀細胞分化。如驅動蛋白家族成員3A 是已知的哮喘易感基因,它可通過氣道上皮細胞中的Th2介導的途徑調節氣道過敏原反應。Runt相關轉錄因子2也與杯狀細胞分化密切相關[23]。使用Runx相關轉錄因子2的sh RNA 干預后的小鼠也顯著減少了氣道黏液的產生和改善肺功能。另外miRNA 在影響上皮細胞分化上的能力也得到越來越多的認可。miR125b在哮喘兒童的痰液中顯著降低,尤其是那些患有嗜酸粒細胞性哮喘的兒童。已顯示miR-125a和miR-125b可直接靶向TNF-α誘導的蛋白3,進而影響杯狀細胞的分化[24]。

3 相關藥物及治療策略

基于上述分析,我們可以發現有多重信號通路可影響杯狀細胞的分化,進而使氣道黏液分泌產生異常,引起哮喘等慢性氣道炎癥反應的加重[7]。針對相關靶點的藥物及可能干預環節,我們總結了以下幾點。但除了這些之外,我們還需要選擇合適的細胞模型或者動物模型,以方便我們進行后續的藥物篩選,靶點確認,藥效評價等[10,15]。

3.1 藥物治療 多年來,杯狀細胞異常分化的癥狀(即黏液分泌過多)而不是調控杯狀細胞分化本身構成了主要的藥理學靶點。這導致了針對黏液溶解/黏液調節活性的化合物數量的大量增加。氨溴索、N-乙酰半胱氨酸和碳半胱氨酸是常用的祛痰藥[7],用于治療具有失調的黏液分泌過多表型的疾病。盡管臨床及動物實驗都已經顯示這些藥物可以改善黏膜纖毛清除率并具有一定的抗哮喘效果[25],但它們并不針對黏液失調的原因,并且通常僅提供晚期改善和癥狀控制[12]。目前已經有一些針對杯狀細胞分化中涉及的關鍵靶點的相關藥物,并且已經產生了許多治療藥物。

皮質類固醇是治療哮喘最常用的處方藥,目前是緩解過敏性哮喘患者氣道炎癥的最有效方法。對于哮喘和COPD 更嚴重的患者,它們通常是無效的[26]。臨床試驗已經表明,布地奈德已被證明可顯著降低哮喘患者杯狀細胞異常分化。此外,皮質酮類藥物如地塞米松已被證明可降低哮喘動物模型中的MUC5AC 產生和杯狀細胞的異常分化。然而,單獨的研究表明,皮質類固醇戒斷后,可反彈性的引起杯狀細胞的異常分化,甚至高過前期的過敏原誘導水平。有研究表明布地奈德治療后[27],人支氣管刷和支氣管內活組織檢查中,許多與杯狀細胞分化相關的基因,如ErbB4和PI3K/AKT 信號通路,均受布地奈德影響而上調。因此,雖然皮質類固醇顯然可以有效減少氣道炎癥,但是長期誘導參與杯狀細胞分化的基因可能會增加炎癥外持續性杯狀細胞分化的可能性[28]。

抗膽堿能藥,特別是噻托溴銨,在抗擊COPD 方面顯示出較好的效果,目前抗膽堿能藥已被批準作為難以治療的哮喘的附加治療[29]。盡管乙酰膽堿作為調節支氣管收縮和黏膜下腺黏液分泌的神經遞質的作用最為人所知,但最近的研究結果也支持氣道上皮細胞分泌的非神經元乙酰膽堿的作用[8]。通過噻托溴銨處理可以預防和逆轉由IL-13在人氣道上皮細胞中有炎癥誘導的杯狀細胞異常活化[12]。

山萘酚是一種常見的黃酮類化合物,可作為抗氧化劑,已知可阻斷內質網應激反應。山萘酚減少卵清白蛋白致敏/攻擊小鼠中的嗜酸粒細胞浸潤和炎癥以及下游黏液細胞分化。在除了抑制脂多糖誘導的嗜酸粒細胞趨化蛋白11表達外,山奈酚還能劑量依賴性地降低TNF-α刺激的細胞間黏附分子1在上皮細胞中的表達和整合素β2 在嗜酸粒細胞中的表達,從而減弱嗜酸粒細胞-氣道相互作用。山萘酚被認為通過緩和JAK/STAT6信號通路,最終抑制核因子κB的活化[30]。

包括克拉霉素和雷帕霉素在內的大環內酯類抗生素亦可減輕慢性氣道疾病的癥狀,除了減少氣道高反應性、細胞因子分泌和氣道炎癥之外[31]。在過敏原暴露后,通過大環內酯類抗生素治療后始終觀察到杯狀細胞數量的減少。克拉霉素可顯著抑制IL-13 誘導的杯狀細胞分化。同樣,雷帕霉素已被證明可抑制急性哮喘模型小鼠氣道內的黏液細胞的數量[7]。

另一類藥物是EGFR 酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼。迄今為止,吉非替尼已被確定為杯狀細胞增生的潛在抑制劑。用吉非替尼預處理小鼠7 d,可減輕卵清白蛋白誘導的過敏性氣道癥狀和病理,包括杯狀細胞的異常分化,這種緩解可能是時間依賴性的。因此,吉非替尼可能更適合作為預防藥物來治療與過敏性哮喘相關的過量杯狀細胞分化[32]。

3.2 單克隆抗體治療 大量的研究表明,單克隆抗體因其靶向性好、特異性高、療效佳而受到人們的廣泛關注。在多種疾病中,如哮喘和COPD 等的治療中都具有較大的優勢。其相對小分子藥物而言,優勢主要體現在以下幾點：(1)單克隆抗體具有較好的靶點特異性；(2)它們在分解后不形成有毒代謝物；(3)它們通常具有更長的半衰期。其中最公認的治療靶點是結合并中和IgE,單克隆抗體的嵌合單克隆抗體[33]。奧馬珠單抗是唯一批準用于治療早發性嚴重IgE依賴性哮喘的單克隆抗體,并通過靶向IgE 的高親和力結構域,阻止其與肥大細胞的相互作用起作用。奧馬珠單還顯著降低哮喘患者體內IL-13和外周嗜酸粒細胞,這對氣道重塑的影響很大,尤其是杯狀細胞的分化。其他一些靶點還包括IL-13、IL-5Rα和IL-4Rα等[34]。

3.3 利用miRNA 技術的療法 通過外源性miRNA 的補充,進而靶向參與持久性杯狀細胞異常分化的一些特定蛋白,從而達到哮喘的治療亦是一個可行的治療策略[13]。我們把這些外源性的 miRNA 稱為antagomirs。Antagomirs是與特定miRNA 完全互補的小寡核苷酸,已被證明可導致miRNA 的有效降解。實際上,在小鼠中許多基于antagomir的研究已經取得了較好的結果。例如,哮喘小鼠模型中miR-126和let-7 miRNA 家族的抑制減少了炎癥細胞的總數,促炎性細胞因子的產生以及MUC5AC 的水平。同樣抑制miR-106a或miR221可減輕哮喘小鼠模型中的炎癥。因此,使用miRNA antagomirs和模擬物不僅可以改善持續性杯狀細胞異常分化,還可以改善慢性氣道疾病的其他病理生理學特征[14]。

目前對于antagomirs的遞送,可以采用氣溶膠遞送,這可以增加氣道上皮對藥物的有效利用,并減少全身遞送帶來的潛在不良反應。但在慢性氣道疾病患者中,如哮喘患者中,其氣道黏液層較厚,這對氣溶膠的遞送有一定的影響。我們可以將antagomir分子與黏液溶解氣溶膠性能增強劑(如D-甘露醇)結合,以增加氣道上皮相互作用并允許其轉運到細胞中,此外納米顆粒的吸入技術亦可解決上述問題[33]。

4 結論

氣道中黏液的積累是慢性氣道疾病,尤其是小兒哮喘的關鍵特征。解決慢性氣道疾病期間持續性的杯狀細胞分化是消除腔內黏液積聚,進而引起下游系列病變,對于哮喘的治療至關重要。目前幾種關鍵信號通路的失調可導致哮喘疾病狀態下的持續性杯狀細胞分化異常,如EGFR 信號通路,IL-13、IL-4、IL-5和IL-9,Notch,WNT/β-連環蛋白,STAT6等。而針對上述靶點的治療策略,如相關藥物、相關的單克隆抗體、miRNA 等都可以有效緩解杯狀細胞的異常分化,進而改善哮喘的相關癥狀。后續仍需重點關注相關動物模型,人源化的細胞模型等來進行相關藥物的開發,從而為滿足小兒哮喘的治療提供保障。

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