非小細胞肺癌中KRAS基因突變與PD-1/PD-L1信號通路相關性的研究進展

柴榮 范銀星 趙家義 周慈航 韓一平

1海軍軍醫大學附屬長海醫院呼吸與危重癥醫學科，上海274300；2海軍軍醫大學附屬長海醫院全科教研室，上海274300

鼠類肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viraloncogene，KRAS)是原癌基因RAS家族的成員之一，為肺癌RAS/RAF/MEK/MAPK信號通路中最常見的突變，是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor mutation，EGFR)信號通路下游的重要調節位點，參與細胞生長增殖與分化的調節，其主要突變位點位于12、13和61外顯子[1]。KRAS突變在西方國家肺腺癌中發生率大約為20%～25%，在亞洲人群中約為10%～15%，是最常見的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)驅動基因突變之一。研究業已表明KRAS突變提示患者預后差，化療效果不理想[2-3]。Shepherd等[4]發現KRAS突變與其他突變如EGFR和間變性淋巴瘤激酶突變相互排斥，應用EGFR和間變性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制劑治療效果不理想和原發耐藥[5]。KRAS突變NSCLC迫切需要新的更高效持久的治療方法出現。

程序性死亡受體-1(programmed death 1，PD-1)是免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外N-末端Ig V樣結構域，跨膜結構域和參與抑制信號傳遞的細胞質尾組成[5]。PD-1的配體包括程序性死亡配體1(programmed death ligand，PD-L1)和PD-L2，二者均屬于B7家族[6]。腫瘤細胞內PD-L1/PD-L2的激活能夠下調腫瘤微環境中效應T細胞表面PD-1的表達水平[7]，從而抑制T細胞對腫瘤的免疫應答和誘導免疫逃逸。阻滯PD-1/PD-L1免疫檢查點的單克隆抗體抑制劑可以恢復效應T細胞的功能，促進T細胞介導的腫瘤細胞殺傷效應[8]，為晚期/轉移性NSCLC的治療提供了新的選擇。但是，在接受免疫治療的NSCLC患者中僅觀察到10%～20%的客觀緩解率[9]，需要更特異預測性生物標志物指導接受PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑治療最大獲益人群的選擇。

研究表明KRAS基因突變與NSCLC內PD-1/PD-L1的表達水平以及抗PD-1/PD-L1免疫治療的效果具有相關性，這提示阻斷PD-1/PD-L1信號通路可能是治療KRAS突變NSCLC的新選擇[10]。

1 KRAS與PD-1及其配體的生物學特性

1.1 KRAS的生物學特性 KRAS基因與HRAS、NRAS病毒致癌基因均屬RAS基因家族，主要編碼鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)結合蛋白，與GTP結合激活RAS信號通路，與鳥苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)結合后失活，在調節正常細胞增殖和細胞信號傳導方面發揮著重要作用[11-12]。這一過程主要由GTP-GDP轉換因子及GTP激活蛋白調控。GTP-GDP轉換因子促進RAS釋放GDP，與GTP結合激活RAS蛋白及其下游信號通路。GTP激活蛋白提高GTP酶的活性，RAS迅速轉變為GDP結合的失活狀態，正常細胞中GDP與GTP的比值維持著RAS信號通路的功能[13-14]。RAS突變可削弱GTP酶的活性，引起細胞內RAS癌蛋白的持續級聯激活，導致細胞的失控性增殖與非正常細胞的存活，超過20%的腫瘤中存在RAS驅動基因突變[15]。

與其他肺癌驅動基因不同，KRAS突變在吸煙患者尤其是重度吸煙患者中的發生概率較高，且在吸煙與非吸煙患者中KRAS突變狀態不同。非吸煙患者中多發生顛換突變(G＞A)，在既往吸煙或正在吸煙患者中轉換突變(G＞C或G＞T)更常見[16-17]。另外，與非吸煙患者相比，吸煙患者中KRAS突變狀態也更為復雜，更易出現驅動基因共突變，更高水平的腫瘤突變負荷，瘤內更大量淋巴細胞浸潤，這使得應用抗PD-1或PD-L1抑制劑治療KRAS突變NSCLC成為可能[17]。

1.2 PD-1及其配體的生物學特性 PD-1表達于活化的T細胞、B細胞、自然殺傷細胞等多種細胞中，參與抗病毒感染的免疫細胞表達其配體PD-L1和PD-L2。PD-L1和PD-L2的編碼基因均位于9號染色體(9p24.1)，但二者具有不同的轉錄調節方式和表達模式。PD-L1主要由Th1細胞釋放的細胞因子γ-干擾素誘導產生，而PD-L2的轉錄受到IL4/IL13/STAT6信號通路和Th2釋放的細胞因子的調節，并且PD-L2在Th2介導的免疫應答反應中發揮重要的調節作用，可誘導腫瘤細胞免疫逃逸[18-19]。PD-L1是PD-1的主要配體，主要表達于造血干細胞來源的T細胞，B細胞，樹突狀細胞，巨噬細胞，肥大細胞和非造血干細胞來源的內皮、表皮細胞[20]。PD-1與PD-L1相互作用抑制T細胞轉錄因子GATA-3和T-bet的表達，以及CD8+細胞毒性T淋巴細胞的生長、增殖，從而誘導腫瘤浸潤T細胞的 凋 亡[21-22]。Jiang等[23]發 現PD-L1陽性腫瘤細胞和PD-L1/CD8雙陽性淋巴細胞共同定位于腫瘤團塊中央時，采用PD-1/PD-L1抑制劑治療可達最大腫瘤殺傷效應。

2 KRAS基因突變與PD-1及其配體的關系

2.1 KRAS突變與PD-1及其配體相關性的研究 Calles等[8]通過免疫組織化學對114例KRAS突變NSCLC患者(84例吸煙，30例非吸煙)腫瘤細胞PD-L1/PD-L2和腫瘤浸潤淋巴細胞PD-1的表達水平進行檢測，發現KRAS突變NSCLC患者體內PD-1/PD-L1/PD-L2的表達水平具有異質性。與肺腺癌PD-L1表達陽性率達50%相比，KRAS突變肺腺癌患者的PD-L1陽性表達率較低為24%，尚未確定PD-L1/2的表達水平與KRAS突變具有相關性。

有學者發現PD-1陽性率與KRAS突變具有顯著相關性[24]。在一項對43例肺肉瘤樣癌手術切除標本的研究中顯示腫瘤突變負荷與PD-L1的表達水平明顯相關，73%的PD-L1陽性肺肉瘤樣癌標本存在KRAS突變，KRAS突變是影響瘤內PD-L1表達水平的主要因素之一[25]。Chen等[10]的一項研究提示肺腺癌KRAS過表達可以上調PD-L1水平，與肺腺癌細胞系和組織中的KRAS突變呈正相關。一項meta分析顯示KRAS突變型腫瘤比KRAS野生型腫瘤PD-L1表達的陽性率更高(51%比36%)[26]。Fukuda等[27]發現KRAS和TP53共突變肺腺癌中PD-L1的表達水平更高，這與Dong等[28]的研究結果一致。而Ji等[9]認為KRAS突變與肺腺癌腫瘤細胞內PD-L1的表達水平呈負相關。

迄今，關于KRAS突變狀態與PD-1及其配體相關性的研究結論各異。這可能與PD-L1的檢測試劑、PD-1及其配體陽性表達界值標準、標本數量及部位、患者臨床病理學特征不同以及人口統計學基線不均衡有關。其二者關系仍需統一的標準和大樣本的數據進一步明確。

2.2 KRAS突變與PD-1/PL-1相關性機制的研究

2.2.1 KRAS上調PD-L1及腫瘤浸潤淋巴細胞水平Coelho等[29]利用ER-RASG12V融合共建細胞系證實了癌基因RAS的信號傳導可上調內源性PD-L1表達水平。通過分析RAS激活后的抗原加工和抗原呈遞過程發現KRASG12V突變信號的傳導可顯著降低TAP1、TAPBP、HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2 M的表達水平，說明抗原加工和呈遞過程的破壞以及PD-L1水平的升高共同增強了RAS突變腫瘤細胞的免疫耐受狀態。與此同時，Busch等[30]觀察到KRASG12D突變肺癌小鼠模型中CD8+T細胞明顯擴增，在人NSCLC瘤內KRAS突變與更高水平的CD8+T細胞浸潤相關。且RAS突變在腫瘤發生早期就可存在，KRAS突變可形成腫瘤新抗原，誘導激發細胞毒性T淋巴細胞的殺傷腫瘤作用[31]。多項研究顯示PD-L1的表達水平與吸煙史、高水平的TILs呈正相關[8，32]，這可能與吸煙誘導的大量非同義突變使TILs增多，釋放γ-干擾素上調腫瘤細胞表面PD-L1表達水平有關[33]。晚近，一項關于KRAS突變肺腺癌的臨床病理學特征分析顯示突變組患者瘤內PD-L1、T細胞免疫球蛋白粘蛋白家族成員3、吲哚胺2，3-二氧合酶-1等炎癥相關因子在炎癥細胞中的表達水平均高于野生型組[34]。綜上，KRAS突變NSCLC患者應用抗PD-1/PD-L1抑制劑可能出現更高的反應率。

2.2.2 KRAS共突變狀態影響腫瘤免疫特征 Skoulidis等[35]將KRAS突變肺腺癌分為3個主要共突變亞組，STK11/LKB1(KL亞組)、TP53(KP亞組)、CDKN2A/B(KC亞組)，具有不同的生物學特性與治療反應。STK11/LKB1是應用PD-1/PD-L1抑制劑治療效果的負性預測。因子在小鼠KRAS突變NSCLC模型中發現STK11缺失后招募中性粒細胞釋放腫瘤促進促炎細胞因子的產生，導致T細胞排斥[36]；上調HIF1-α與核轉錄因子的表達水平調節代謝與抗氧化反應，形成葡萄糖耗竭腫瘤微環境，抑制T細胞活性[35-37]。而且，高代謝狀態可促進DNA高甲基化使干擾素依賴基因表達沉默，形成免疫惰性腫瘤微環境，是KRAS突變NSCLC患者免疫治療原發耐藥的重要機制[38]。

研究發現KP亞組具有更高水平的體細胞突變負荷，炎癥標志物和免疫檢查點效應分子的表達，是采用PD-1/PD-L1抑制劑治療的正性預測因子[35]。Miura和Swnaga[39]闡述了TP53基因突變對KRAS突變NSCLC腫瘤免疫微環境的影響主要體現在以下3個方面:(1)TP53/KRAS共突變時可提高腫瘤突變負荷水平，其PD-L1的表達水平最高，瘤內共表達PD-L1與浸潤CD8+T細胞的比例也最高，相應的淋巴細胞活化3等非PD-L1免疫檢查點效應分子的表達水平減低；(2)KRAS突變可導致多種DNA修復缺陷，其中包括錯配修復基因突變。有學者利用生物信息技術分析，發現錯配修復突變與PD-1/PD-L1抑制劑治療效果呈正相關性[40]。(3)TP53突變增加了與DNA校對外切酶活性破壞相關基因POLE的突變頻率，導致更高的腫瘤突變負荷水平。TP53/KRAS共突變NSCLC患者在應用免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint blocker，ICB)治療中獲益更顯著[28]。

2.2.3 RAS調節PD-L1表達的信號通路 RAS通過抑制鋅指蛋白36結合AU富集元件，減少PD-L1 m RNA的降解，從而增強PD-L1 m RNA的穩定性，上調腫瘤細胞內PD-L1的表達水平。鋅指蛋白36通過AU元件結合位于PD-L1 m RNA上的3'UTR，使得PD-L1 m RNA降解，負向調節PD-L1的表達。該研究還揭示了RAS基因突變可能通過RAS/MEK/ROS/p38/MK2(MAPKAPK2)這一信號通路抑制TTP活性，誘導PD-L1表達。應用MEK抑制劑可降低PD-L1 m RNA的穩定性，同時提高TTP的表達水平和減少其磷酸化，逆轉RAS持續激活所致的PD-L1表達 增 加。Chen等[10]利 用KRAS突變細胞系H358(G12C)發現，KRAS基因過表達通過p-ERK而非p-AKT信號通路上調腫瘤細胞內PD-L1表達水平，誘導CD3+T細胞凋亡，導致肺腺癌腫瘤細胞的免疫逃逸。應用Pembrolizumab或ERK抑制劑可恢復T細胞的抗腫瘤免疫能力，降低KRAS突變NSCLC細胞的存活率。

研究發現KRAS突變NSCLC瘤內PD-L1/PD-L2的表達水平也具有異質性[27]。與TP53基因突變的腫瘤具有較高的炎癥標記物和免疫檢查點效應分子水平不同，存在STK11/LKB1改變的KRAS突變腫瘤內表達較低水平的免疫標記物包括PD-L1。研究顯示無LKB1突變時，PD-L1/PD-L2的表達頻率更高，PD-1配體的表達可能需要完整的LKB1/AMPK信號傳導通路[8]。但編碼PD-L1的CD274 m RNA表達水平在KRAS突變的NSCLC細胞系中差異較大，意味著還存在其他機制調控著不同KRAS突變狀態NSCLC中PD-L1的表達。

3 KRAS基因突變與抗PD-1/PD-L1抗體治療效果的關系

一項Ⅰ期臨床試驗中發現，21例KRAS突變患者中1例Avelumab治療有效，EGFR和間變性淋巴瘤激酶突變患者中未發現有反應者[41]。Nivolumab與多西他賽的Ⅲ期臨床試驗中也提示KRAS突變肺腺癌患者可能從ICB治療中受益[42]。Davar等[43]報道了一例全身多處轉移晚期KRAS突變肺腺癌患者應用Nivolumab單藥獲得完全緩解的案例。一項薈萃分析研究納入了Checkmate 057、OAK、POPLAR三項臨床試驗中519例明確KRAS突變狀態的患者表明，與二線接受多西他賽治療相比，KRAS突變NSCLC患者應用ICB治療可延長患者總生存期，而在KRAS野生型患者中未表現出此種生存優勢。但該研究中不同KRAS突變狀態患者應用免疫檢查點抑制劑的治療效果無統計學差異，尚不足以推薦KRAS突變作為ICB治療效果的預測標志物[44]。新近，Passiglia等[45]進行了一項KRAS突變NSCLC患者多線應用Nivolumab治療的真實世界研究。這是目前針對KRAS突變在晚期非鱗狀NSCLC患者接受Nivolumab治療評估其預測作用的一項最大研究，共納入206例KRAS突變型患者及324例KRAS野生型患者，2組患者的疾病客觀緩解率、疾病控制率、中位無進展生存期、中位總生存期均未顯示出明顯差異，且KRAS突變可能與免疫治療不良反應的發生率呈正相關。由此推測KRAS突變狀態并不是Nivolumb治療效果的可靠的預測指標。

目前，針對KRAS突變NSCLC這一特定亞群接受抗PD-1/PD-L1治療的研究相對較少，存在患者的基線臨床特征不平衡、不同的ICB治療方案等問題，KRAS突變對ICB治療效果的預測作用仍需在臨床研究中進一步探索。

4 展望

越來越多的證據表明，單一的生物標志物可能無法完全預測免疫治療的臨床反應情況。分析不同基因突變類型與腫瘤免疫微環境的相互作用機理在提高靶向治療聯合免疫治療的臨床效果以及免疫治療最大獲益人群的選擇方面具有重要意義和廣闊前景。KRAS突變NSCLC具有生物學異質性，新型治療策略的開發存在許多挑戰，免疫治療可能是KRAS突變型NSCLC最有前景的新療法之一。未來仍需進一步闡述KRAS突變在PD-1/PD-L1信號通路的作用，以及更大樣本的臨床數據探索免疫治療在KRAS突變NSCLC患者中的應用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突