慢性阻塞性肺疾病動物模型的研究進展

葉榮琛 嚴國林 楊伊霖 蔡嘉威 鐘臻蔚 朱瑩瑩 周玉民

1廣州醫科大學南山學院511436;2廣州呼吸疾病研究所呼吸疾病國家重點實驗室510120

COPD 是一種常見的,可以預防和治療的肺部疾病,其特點表現為持續的呼吸癥狀如咳嗽和呼吸困難以及氣流受限,其發病與吸煙或生命早期不良接觸史的協同作用以及有害顆粒或氣體引起的氣道和肺泡病變有關[1]。我國最新的大規模COPD 流行病學調查顯示,我國COPD 患者人數約達一億人,20歲及以上成人的COPD 患病率為8.6%,40 歲以上則達13.7%,60 歲以上人群患病率已超過27%[2]。COPD 發病受遺傳因素和環境因素的雙重影響,目前研究較多的發病機制包括慢性炎癥反應、蛋白酶抗蛋白酶失衡、免疫反應失調、氧化應激和細胞凋亡等。作為臨床前疾病機制研究的重要途徑,建立COPD 疾病動物模型是COPD 各類研究工作的基礎。近幾年隨著COPD 發病機制研究及進展的深入,出現了多種新的COPD 動物模型的構建方式,我們就當前COPD 動物模型的最新研究進展作一綜述。

1 COPD造模動物的選擇

目前已有許多實驗動物被應用于COPD 動物模型的造模中,包括小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、豬及其他靈長類動物等。對于實驗動物的選擇,實驗者主要從解剖結構、病理變化、可行性及經濟方面進行考慮。目前應用較多的為鼠類,常見的小鼠COPD 品系包括C57BL/6、BALB/c和A/J小鼠等,其優缺點如下。

小鼠COPD 模型具有以下優點：(1)已經具有明確的小鼠基因信息,且其與人類基因組接近,僅有約300個基因不同；(2)實驗用抗體種類豐富； (3)小鼠品系繁多,且不同品系對煙草煙霧的反應存在差異,可供不同需要進行選擇[3]；(4)易于制備轉基因小鼠；(5)近交系小鼠的應用消除了遺傳變異的問題；(6)小鼠繁殖周期短,數量多,實驗費用相對較低。但小鼠也存在相應缺點： (1)小鼠呼吸系統和人類之間存在明顯的生理學差異,如小鼠氣道幾乎沒有黏膜下腺,導致其不能引起黏液高分泌的病理變化；(2)小鼠擁有不同于人類分叉狀的單軸氣道分支模式,其支氣管分支數量與人類相比也大大減少[4]；(3)人與小鼠的免疫系統有較大的差別；(4)小鼠并不總是表達與人類相同的蛋白質。大鼠的優缺點與小鼠相似[5]。除鼠類以外,有些研究選用豬、羊或靈長類動物,這一類動物無論是在解剖結構亦或是病理變化上都與人類更為接近,但由于其飼養和實驗成本高,且因涉及倫理問題而無法大批量進行實驗,故應用范圍較為局限。

2 常見造模方法及模型評價

2.1 氣道吸入

2.1.1 香煙煙霧暴露 吸煙是目前COPD 最常見的病因,香煙煙霧暴露模型能復制多種COPD 病理生理改變,包括肺氣腫樣改變、氣道慢性炎癥、氣道重塑、氧化應激、血管重塑及肺動脈高壓等。Liu等[6]將雄性SD 大鼠全身暴露于香煙煙霧中,每次10支香煙,每天2次,持續4個月造模成功。然而全身暴露于香煙煙霧中可能使尼古丁等煙草有害物質通過動物皮膚黏膜或在動物整理皮毛時進入體內[7],因此單純口鼻暴露于香煙煙霧較全身暴露更符合人類吸煙行為習慣。Shu等[8]通過比較全身暴露及口鼻暴露2種COPD 小鼠模型建立方法發現,僅采用口鼻暴露可以減少小鼠因皮膚煙霧殘留出現的瘙癢、不適、戰斗等行為,且在口鼻暴露模型中,小鼠的煙霧吸入量可以更準確地控制,實驗結果更易重復。香煙煙霧暴露模型通過全身暴露或口鼻暴露模擬人類吸煙過程,可復制多種人類COPD 病理改變,是較為理想的模型。但香煙暴露模型一般造模時間較長,普遍在數個月至半年以上,造模過程耗費較多人力物力。香煙煙霧暴露患者在停止暴露后病理生理變化仍有進展加重,但動物模型停止香煙煙霧刺激后病理生理改變是否進展仍存在爭議,需要進一步探究[9]。

2.1.2 可吸入顆粒物質 (particulate matter,PM)暴露PM 是空氣污染中的主要成分,而PM2.5被認為在COPD的發病機制中具有關鍵作用。已有研究證明,隨著PM 的直徑減小,其穿透小氣道并進入體循環的能力增強[10]。近年來,研究表明空氣污染與COPD 的發病及疾病進展有密切關系[11]。最近的研究主要集中在兩大空氣污染源,即生物質燃料和機動車尾氣[12]。He等[13]將64只雌性SD 大鼠分別暴露在生物質燃料、機動車尾氣污染空氣的PM 中,每天4次,每次1 h,每周5 d,持續7 個月,成功建造COPD 動物模型,其呼吸系統病理改變與人類COPD 患者病理變化一致,包括肺部炎癥,肺氣腫,小氣道重塑,氣道黏液分泌過多,肺功能減退和全身性炎癥反應。而王光艷等[14]將Wistar大鼠暴露在濃度為500μg/m2的PM2.5中,為期3個月,同樣成功構建大鼠肺氣腫模型。污染空氣PM 暴露的動物模型較好地模擬了暴露于污染空氣的人類COPD 患者的過程及病理變化。但該模型制作時間較長,且目前PM 的制作過程繁瑣,制作方式多樣,難以控制PM 中各成分比例,也未能控制其他可能誘導COPD 的有害氣體的濃度,如二氧化硫 (sulfur dioxide,SO2)、二氧化氮 (nitrogen dioxide,NO2)等。

2.1.3 其他有害氣體暴露 除香煙煙霧及PM 以外,其他有害氣體如SO2、NO2和臭氧等也可用于COPD 動物模型的構建。Wiegman等[15]將雄性C57BL/6小鼠暴露在O3中長達6周,成功制造COPD 小鼠模型。Wegmann等[16]將雄性C57BL/6小鼠暴露在吸入濃度為20 ppm 的NO2中,每天14 h,持續25 d,成功建造COPD 小鼠模型。Wagner等[17]將雄性SD 大鼠持續暴露在吸入濃度為20 ppm 的SO2中,持續25 d,成功建造COPD 大鼠模型,其病理改變符合COPD 樣改變,此外還存在黏液分泌增多的特征性改變。

2.2 氣管注射

2.2.1 氣管滴注蛋白酶 蛋白酶-抗蛋白酶失衡學說是COPD 的重要發病機制,吸煙、氧化應激、有害氣體或有毒物質可引起蛋白水解酶的增多或抗蛋白酶的不足。通過氣管內滴注蛋白水解酶能復制出肺氣腫模型,而常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶以及人中性粒細胞彈性蛋白酶。Tibboel等[18]通過向C57BL/6 小鼠氣管內滴注4.8單位/100 g的豬胰蛋白酶,成功造出肺氣腫模型。毛旻等[19]通過向小型豬氣管內注入6 單位/kg木瓜蛋白酶,每周1次,持續5周,成功誘導COPD。氣管內滴注蛋白酶具有感染少、操作簡便、注藥劑量易掌握、造模時間短等優點。但酶的種類、劑量以及動物的品種、年齡對造模結果影響巨大,需要統一標準及嚴格控制。且此類動物模型容易誘導嚴重的肺氣腫病變,但與人類常見的由于長期煙霧暴露慢性刺激引起的致病過程與病理變化不完全一致。

2.2.2 氣管注射致病菌及菌液成分 除了氣管內滴注彈性蛋白酶,也可通過注射致病菌或菌液成分誘導COPD。在氣 道 中 病 菌 通 過 不 斷 繁 殖 并 釋 放 脂 多 糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖和多種酶刺激氣道產生的慢性炎癥反應,造成氣道的損傷,從而實現其致病作用。許滸等[20]將Wistar大鼠注入肺炎克雷伯桿菌液0.1 ml,每周2次,持續2個月,成功制造具有COPD 病理學特征的動物模型。此外,氣管內滴注LPS也可用于制作COPD 動物模型。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的成分,可以刺激單核細胞、中性粒細胞合成釋放大量炎癥因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-1β、破壞蛋白酶-抗蛋白酶平衡,介導呼吸系統炎癥反應。Vernooy等[21]將雄性Swiss小鼠氣管內滴注LPS,每次5μg,每周2次,持續12周,成功制作出COPD 小鼠模型。上述模型具有造模時間較短,操作方便等優點,且Sethi 和Murphy[22]的研究認為細菌感染可能是COPD 重要的致病因素,氣管內注射細菌致COPD 動物模型模擬了這一發病過程。但其發病機制尚未完全清楚,此類COPD 動物模型可為后續研究提供方法學支持。

2.3 腹腔注射

2.3.1 腹腔注射香煙煙霧提取物 使用香煙煙霧提取物誘導COPD 動物模型也是一種常用的造模方法。Chen等[23]通過點燃香煙,將煙霧過濾去除顆粒物和細菌后裝入含有PBS (1 ml/支)中制成CSE-PBS溶液,并使用6周齡雄性SD 大鼠,在第1、8、15天分別腹腔內注射1 ml CSE-PBS溶液,在3 周內成功誘導出肺氣腫大鼠模型。CSE 誘導COPD 動物模型造模時間短,操作簡單,病理生理變化與人類COPD 接近,但容易受到CSE溶液成分及實驗動物的品種、年齡、給藥方式和時間等因素的影響。腹腔注射CSE誘導COPD 的作用機制和途徑尚不明確,可能使Th1細胞活化,炎癥因子增多,進而導致蛋白酶-抗蛋白酶失衡,造成氣道炎癥反應及肺結構破壞,需要進一步的探究[24]。

2.3.2 腹腔注射內皮細胞及血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)受體阻斷劑 近年來,研究發現細胞凋亡是重要的COPD 發病機制之一。劉紹坤等[25]報道在COPD 動物模型及患者身上發現肺泡上皮細胞凋亡指數及肺血管內皮細胞凋亡指數均升高且呈正相關,肺血管內皮細胞凋亡可引起肺泡間隔結構破壞消失,進而引起肺氣腫。而成人肺中可產生大量的VEGF 蛋白,通過與其受體相結合而發揮促內皮細胞存活和抗凋亡的功能。Kasahara等[26]通過在雄性SD 大鼠皮下注射VEGF受體阻滯劑SU5416,直接導致肺毛細血管內皮凋亡,成功在3周后觀察到大鼠肺泡間隔細胞凋亡,其病理改變符合肺氣腫模型。Taraseviciene-Stewart等[27]將人臍靜脈內皮細胞腹腔注射于免疫功能正常的SD 大鼠,3周后檢測到內皮細胞抗體,且有肺泡間隔細胞凋亡等肺氣腫樣病理改變,成功建立自身免疫性肺氣腫模型。細胞凋亡模型的特點在于肺組織中無明顯炎細胞聚集等炎癥表現,僅有肺泡腔擴大、血管重塑等變化,無明顯氣道病理改變,不完全符合COPD 患者病理變化,其作用機制仍待進一步明確。

2.4 基因工程技術 除上述傳統COPD 動物模型,基因相關的肺氣腫動物模型也是近年來的研究熱點。部分研究使用了不同品系的基因突變小鼠,這些小鼠抗氧化能力及抗蛋白酶表達水平不同,且對煙霧的炎癥反應也存在差異,因此對香煙煙霧暴露存在不同的反應[28]。基因工程小鼠也可通過基因敲除滅活VEGF基因,使肺部VEGF及VEGF受體2表達水平大幅下降,誘導出肺氣腫樣病理變化[29]。某些特定基因的組成性過度表達同樣可以導致肺部異常發育,如IL-13和干擾素-γ的過度表達,可引起炎癥反應及肺泡腔擴大等病理表現[30-31]。但基因的組成性表達會加速動物衰老,從而導致肺氣腫的發生[32]。基因工程動物模型不符合人類COPD 患者的自然發病過程,不適合用于探究人類COPD 發病機制,且大量過表達的蛋白質也可能發揮與生理劑量不同的生理作用,在研究中需要考慮到這一點[28]。但此類模型可為進一步探究某些基因在COPD 發病過程中的作用提供支持。

2.5 多因素聯合模型 人類COPD 患者的發病機制復雜,單一的造模方法難以模擬人類COPD 的病理變化和臨床特征。建立標準化、符合臨床實際的COPD 動物模型一直是國內外學者探索的難題,使用聯合刺激方法構建COPD 動物模型不僅較好地還原人類COPD 的病理變化,且相比單一因素刺激更加節約時間和人力,同時也能在COPD 的基礎上構建相關并發癥或急性加重模型。余常輝等[33]通過對比單純煙熏和煙熏聯合氣道內滴注LPS兩種方法誘導原發性高血壓大鼠慢性肺阻塞模型,觀察到煙熏聯合LPS組較單純煙熏組表現出更明顯的氣道炎癥、肺氣腫及氣道阻力增加,并且肺組織核因子κB信號通路激活、下游炎癥瀑式反應及SP-A 減少都較明顯,證實煙熏聯合LPS組建立的高血壓大鼠COPD 模型能更好的模擬人類慢性支氣管炎及阻塞性肺氣腫的形態學、功能學以及病理生理學改變。

3 模型評價

3.1 肺功能檢測 肺功能檢測對于研究動物呼吸生理功能的基本狀況特別是判斷是否出現氣流受限具有重要的意義。有創肺功能檢測主要具有敏感性和特異性高、可排除上氣道阻力的影響等優點,但由于具有有創性與實驗復雜性,其不能重復測量及實驗耗時長的特點也較為顯著。相比之下,無創方法具有對動物創傷小,因而允許在多個時間點重復測量且方法方便快捷的特點,故多用于需要重復測量且動物量較大的研究[34]。無創方法主要為體積描記法及強迫振蕩肺功能技術[35]。常用的肺功能檢測指標有呼氣峰流速、潮氣量、每分鐘通氣量、動態肺順應性、吸氣阻力、呼氣阻力、氣道阻力、用力呼氣容積、用力肺活量以及兩者的比值等。其中不同實驗對FVC的測定時間的選擇有所不同,常見的有0.05 s、0.1 s、0.2 s及0.3 s。

3.2 病理學檢查 病理學檢查通過將新鮮氣道及肺實質組織置于固定液中進行固定,并進行石蠟包埋、切片,行HE 染色,于光學顯微鏡下觀察,從而判斷其病理變化是否符合COPD 樣改變。用于評估氣道病理改變的指標有：炎癥細胞計數并通過半定量評分系統對其炎癥程度進行分級；通過Masson 染色評估膠原沉積程度；通過AB-PAS染色檢測黏多糖分泌情況；支氣管壁厚度/直徑以及平滑肌細胞橫截面積等。而評估肺氣腫病理改變的常用指標包括平均線性截距、肺泡平均截距、平均肺泡數量、肺泡比例以及肺泡破壞指數。

3.3 炎癥細胞及介質檢測 除上述肺功能及病理學檢測外,支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和血清中炎癥細胞及炎癥介質水平也可作為COPD動物模型判定標準之一。BALF 制取過程常通過對全麻動物模型進行氣管插管,選擇生理鹽水或緩沖液,行單側或雙側肺泡灌洗并留取BALF,BALF 常溫離心后所得的細胞成分可用于細胞計數分析,所得上層清液可用于炎癥介質等指標的測定。

3.4 其他指標 除了上述評價指標,氧化應激、蛋白酶及抗蛋白酶指標也可用于評價COPD 動物模型。在COPD 動物模型中常測的氧化應激指標包括丙二醛以及過氧化物酶、超氧化物歧化酶和一氧化氮等[36]。其中丙二醛質量分數變化可反映肺受自由基攻擊,脂質過氧化的程度。超氧化物歧化酶是需氧代謝細胞中的自由基清除劑,其活力可反映機體清除自由基的能力。由中性粒細胞產生的中性粒細胞彈性蛋白酶和巨噬細胞產生的基質蛋白金屬酶 (matrix metalloproteinase,MMPs)、金屬蛋白酶抑制劑 (tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)、抗胰蛋白酶等為蛋白酶/抗蛋白酶中的主要成員[37],可通過免疫組織化學法來檢測它們的表達。MMPs是降解氣道細胞外基質成分的主要蛋白酶類,在研究中多以MMP-9 為重。已發現的TIMPs均由巨噬細胞和結締組織細胞產生,其為MMPs特異的組織抑制因子,兩者的動態平衡對維持細胞外基質和呼吸道結構的穩定有重要的意義,其中以研究TIMP-1多見。

4 總結與展望

人類COPD 具有復雜的病因及發病機制,目前尚無一種COPD 動物模型可以完全模擬人類COPD 所有特征,大部分動物模型主要模擬其中一種發病機制。煙草煙霧暴露模型可模擬相對較復雜的病理改變,且較好地模擬了人類COPD的致病過程,是目前最常見且較為理想的動物模型。近年來,隨著COPD 流行病學相關研究發現除香煙煙霧以外,生物質燃料及機動車尾氣相關污染空氣也是COPD 重要致病因素之一。因此,使用污染空氣PM 構建COPD 動物模型成為一種可行的新興建模方法。隨著COPD 動物模型的發展,將會出現能更好地模擬人類COPD 致病機制及病理生理改變的動物模型,使我們對COPD 的病因及疾病發展過程有更深入的理解。

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