細胞外囊泡在肝細胞癌診斷及預后判斷中的潛在應用價值

曾婉嘉 于廣鑫 魯鳳民

肝細胞癌(HCC)是全球癌癥相關死亡率的第三大原因，其主要危險因素包括慢性病毒性肝炎、酗酒及非酒精性脂肪性肝病等。HCC死亡率高的主要原因之一是早期檢出率低，大部分患者在確診時已處于疾病進展期，可選治療方式少，預后不佳。肝臟超聲(US)是最廣泛用于肝癌早期篩查的影像學檢查，相對于MRI和CT而言，US具有操作難度小、花費較低的優勢，但其靈敏度也相對較低。臨床上常將血清甲胎蛋白(AFP)水平用作US的輔助手段，可以在不顯著降低特異性的前提下，提高監測的靈敏度。除了AFP以外，AFP異質體(AFP-L3%)和異常凝血酶原(DCP)等也在早期HCC篩查和診斷中表現出了較好的應用前景[1]。

近年來，“液體活檢”這一新的非侵入性的診斷概念受到了越來越多的關注，其針對循環腫瘤細胞、循環腫瘤DNA、游離微小RNAs(microRNAs, miRs)和細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)等進行檢測，以實現腫瘤的早期診斷。例如可通過循環腫瘤DNA來檢測癌細胞的單核苷酸多態性、染色體拷貝數變異及甲基化變化等[2]。而包括外泌體在內的EVs因富含大量的miRs、DNA碎片和蛋白質等信息，具有作為生物標志物的巨大潛力。

一、EVs的形成機制、純化及檢測

EVs是活細胞分泌的、由脂質雙層膜包裹的囊泡，根據其生物學方式分為三類：外泌體、微泡和凋亡小體。外泌體由多囊泡體與質膜融合，將管腔內囊泡釋放至細胞外而形成，直徑30～150 nm之間，富含CD81、CD63和CD9等標記物；微泡由質膜出芽直接形成，直徑在50～1 000 nm 之間；凋亡小體由細胞凋亡過程中等離子體膜起泡或細胞破碎形成，直徑一般超過500 nm[3]。不同種類的囊泡在大小上有一定的重疊，所以需要依靠其生物發生以及釋放到細胞外環境的方式進行區分。

目前EV純化方式有很多種，如根據要獲得的囊泡的大小和密度，利用轉速分離的差速離心法；基于一定的離心力下將EVs分配到密度梯度中某些特定位置上，形成不同區帶進行分離的密度梯度離心法；基于EV大小不同進行分離的大小排阻色譜法以及根據不同EV表面標志物的差異進行分離的磁珠免疫親和法等。不同技術在靈敏性、特異度和操作復雜度上各有優缺點。對于EV顆粒大小的檢測，常用的技術有透射電子顯微鏡、動態光散射分析、納米粒子跟蹤分析(NTA)和流式細胞術(FC)，其中NTA和FC不僅可以檢測EV顆粒的大小，還可以計算EV顆粒的濃度。在對囊泡內容物的檢測方面，EV內蛋白質和RNA的種類及含量常用于疾病的監測，可以通過ELISA、Western-blot、質譜等方法檢測蛋白，利用RT-qPCR、mRNA-seq和miRNA-seq測量RNA[4]。

二、EVs在HCC診斷及預后判斷中的應用

EVs在細胞間通訊中發揮著重要作用，參與了很多生理及病理進程，包括腫瘤的發生、發展。一方面，抗原呈遞細胞可通過攝取腫瘤細胞衍生的EVs所攜帶的抗原，激活CD8陽性T細胞，發揮抗腫瘤活性；另一方面，腫瘤細胞分泌的EVs中含有多種免疫調節因子，可以誘導局部微環境的免疫抑制，甚至影響循環免疫細胞的功能。此外，EVs中還含有大量促增殖和血管生成的細胞因子，極大地增強了腫瘤的增殖、轉移及侵襲能力。許多研究表明，EVs的內容物在不同人群中存在差異，可通過測定其中的RNA、蛋白質及DNA水平等來對正常人群、原發性及復發性HCC患者進行鑒別[3]。不僅如此，EVs的內容物有外層脂質膜的保護，能夠穩定地存在于循環血及體液中，其分離方式對患者的創傷小，可作為HCC診斷及預后判斷的潛在標志物。

(一)RNAs 外泌體中有豐富的miRNAs，且與HCC及其復發密切相關。Sugimachi等[5]對HCC患者血清外泌體中miRs的表達譜進行分析發現，復發患者術前血清外泌體miR-718水平顯著低于無復發患者，進一步實驗證實，miR-718下調可導致HOXB8水平上升，促進HCC的發生和轉移。分析患者血清外泌體功能性miRs的水平，不僅可以對HCC患者進行診斷，還可預測其復發風險，有利于治療方案的選取。

長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)也參與了腫瘤的發生、發展，可作為HCC診斷的生物標志物。研究表明，HCC患者血清外泌體中的ENSG00000258332.1和LINC00635水平顯著高于慢性乙型肝炎和肝硬化患者，且與門靜脈腫瘤栓塞、淋巴結轉移、TNM分期及總生存期相關。此外，將這兩種lncRNAs與AFP聯用可提高HCC診斷及預后判斷的準確性[6]。

(二)蛋白質 外泌體攜帶的蛋白質同樣在HCC發展中起到重要作用。實驗表明，貼壁生長的HCC細胞衍生的外泌體中含有SMAD家族成員3(SMAD3)蛋白，有助于HCC細胞的黏附。外泌體中SMAD3蛋白的豐度與HCC的分期、病理分級和術后患者的無病生存率都有很高的相關性[7]。除可促進癌細胞遷移的SMAD3蛋白外，HCC細胞衍生外泌體中的多種鈣結合蛋白、糖代謝調節蛋白等表達水平都與正常組織有顯著差異，這使得外泌體中的蛋白質有著輔助診斷HCC及復發風險預測的潛力[8]。

(三)DNA 目前多數研究都集中在外泌體中的RNAs和蛋白質在HCC診斷方面的應用，關于HCC細胞釋放的外泌體中DNA的功能及診斷價值尚缺乏詳細報道。最新的研究表明，HCC患者血清中游離HBV DNA整合片段可用于腫瘤檢測及術后復發風險預測。研究者檢測了50例HBV相關HCC患者術前及術后兩個月的血清樣本中的病毒-宿主嵌合DNA片段，結果顯示，88%的HBV相關HCC患者血清中能檢測到病毒整合片段，且絕大部分患者血清中的病毒-宿主嵌合DNA拷貝數與腫瘤大小存在相關性[9]。值得注意的是，對比術前及術后整合片段的序列，26.2%的患者術后血清樣本中的病毒-宿主嵌合DNA特征與基線時一致，而這些患者中有81.8%在1年之內就出現了HCC復發，這些結果提示，病毒-宿主嵌合DNA可用于HBV相關HCC的檢測及預后判斷，同時它還可與AFP聯用以獲得更好的診斷和預測價值。此前我們的研究也顯示，絕大部分復發性HCC的DNA甲基化模式與其原發灶極為相似；而在HBV相關HCC的原發-復發癌配對樣本中，可以檢測到幾乎完全相同的病毒-宿主嵌合DNA片段[10]。由于病毒整合片段可被釋放到外周血中，因此也存在被包裹進EVs中的可能。雖然目前尚無文獻報道，但EVs中的DNA比游離DNA更穩定，且純化后容易進行定量檢測，具備用于HCC檢測及判斷其復發風險的潛能。

三、EVs在HCC治療中的應用探索

除了上述在實驗室診斷方面的應用之外，EVs免疫原性低，生物相容性好，被認為是良好的遞送載體，因此也有很多研究在關注其在HCC治療方面的應用。miR-335已被報道具有腫瘤抑制作用，HCC細胞中miR-335表達水平普遍下調。有研究者利用肝星狀細胞衍生的EVs將治療性miR-335運輸到HCC細胞內，抑制腫瘤增殖和轉移，達到了良好的治療效果[11]。而我們近期的研究發現，將CRISPR系統導入細胞內進行基因編輯時，Cas9蛋白和gRNA均可進入外泌體中，從而被其他細胞攝取并發揮基因編輯作用[12]。提示在體內應用CRISPR/Cas9技術對腫瘤進行治療時，需要考慮到外泌體中有基因編輯活性的gRNA和Cas9蛋白可能帶來的影響。

近年來越來越多的證據表明，EVs在HCC細胞的增殖、侵襲和轉移中都有著重要作用，其攜帶的miRs、lncRNAs、蛋白質及DNA片段等均可作為HCC診斷和預后判斷的標志物。但要將EVs實際應用于臨床診斷還存在很多困難，如何快速且特異性地分離EVs的各種組分并對其進行檢測還有待進一步探究。目前關于EVs診斷效能評價的研究較少，研究隊列規模普遍偏小，還需要更大的樣本量和多中心研究進一步驗證。