藥物性肝損傷潛在的新型生物標志物：細胞外囊泡

金銀鵬 王皙 傅青春

藥物性肝損傷(DILI)可致急性肝功能衰竭甚至死亡，迄今仍缺乏敏感、特異的診斷標記物。如何早期識別并干預，及時更改用藥方案以避免持續性肝損傷，具有重大臨床意義。目前臨床常用肝損傷指標如血清ALT、AST等對DILI的診斷缺乏特異性，且在肝組織損傷較重時才有所變化，蛋白質組學、代謝組學等研究發現胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)來源的某些microRNA、mRNA、蛋白質、代謝物等在DILI中變化較傳統肝損傷標志物更早，提示EVs具有早期診斷DILI的價值。本文將從EVs內所含RNA和蛋白質作為DILI早期診斷的新型生物標志物進行綜述，為DILI的早期診斷提供思路。

對乙酰氨基酚(APAP)、異煙肼、氟烷等多種藥物均可誘導DILI的發生[1]。其發病率取決于藥物潛在的肝毒性及宿主的生理狀態，如營養不良、肥胖、前驅糖尿病及慢性飲酒等。DILI患者6個月死亡率或接受肝移植率可達10%以上，其余患者仍有20%存在持續性肝損傷。傳統的DILI診斷生物標志物ALT、AST等的升高與肝細胞死亡密切相關，但其組織特異性差，ALT的異構體ALT1、ALT2在腎臟、肝臟、脂肪和肌肉組織中也可高表達[2-3]。此外，肝酶的升高晚于肝組織的病理變化，無法對DILI進行早期診斷。

近年來，蛋白組學技術的發展推動了DILI生物標志物研究進程。研究發現肝細胞來源的EVs可作為DILI診斷的生物標志物。EVs包含多種功能性物質，如蛋白質、RNA(包括mRNA、microRNA、IncRNA和其他RNA)、DNA(mtDNA、ssDNA、dsDNA)、脂質及完整的細胞器(線粒體)等。根據EVs來源，可分為凋亡小體(直徑50 nm～5 μm，細胞凋亡后形成，代表細胞碎片)、微囊泡(直徑50～1 000 nm，細胞膜向外出芽裂變形成)及外泌體(直徑40～100 nm，細胞膜向內出芽裂變形成)。細胞分泌的EVs可直接作用于周圍細胞或通過血液、尿液、唾液等多種途徑進行遠距離作用。EVs可通過表面分子抗原抗體反應與受體細胞結合，或非特異性內吞作用進入受體細胞釋放所含物質，改變受體細胞生理或病理過程[5]。EVs可反映起源細胞類型及病理生理狀態。本文從EVs所含蛋白、RNA或代謝物等物質作為DILI早期診斷的生物標志物進行闡述。

一、各類EVs的起源及特征

不同細胞或器官來源的EVs存在明顯的異質性。EVs可根據大小和密度分為大、中、小EVs。不同類型EVs的表面分子表達具有共性也有差異性，例如：各類EVs均表達I/II型主要組織相容性復合體(MHC-I/-II)及熱休克蛋白70(HSC70/HSP73和HSP70/HSP72)，然而GP96及應激相關蛋白質僅在大型EVs中表達，actin-4及其他線粒體蛋白質在小型EVs中不表達。此外，synteinin-1、TSG101、ADA10及EHD4僅表達于小型EVs。

小型EVs(外泌體)是細胞經過“內吞-融合-外排”等一系列調控過程形成的膜性脂質囊泡，透射電鏡下可見典型的“杯口狀”形狀。外泌體所含共性蛋白質主要來自細胞膜、高爾基體和內質網等生物膜。如內源性蛋白(MVBs)、四跨膜蛋白超家族(如CD63、CD9 和CD81)、微管蛋白、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)等。以上保守型蛋白質可幫助外泌體滲透、入侵及融合入靶細胞及外泌體鑒定。如：B細胞來源外泌體四跨膜蛋白超家族(CD37、CD53、CD63、CD81、CD82)表達多達7～124倍，這些蛋白質是細胞質膜和早期核體的標志[14]。細胞受損時分泌的外泌體所含物質發生變化。外泌體所含物質參與靶細胞的生理或病理過程，如：免疫反應、腫瘤轉移、蛋白清除及基因交換等。

微囊泡是細胞膜向外突起后斷裂釋放入周圍環境的囊泡，此過程類似于細胞分裂的最后一步。研究發現，微囊泡的脫落機制包括脂質聚合不對稱、細胞內鈣信號刺激及膜彎曲蛋白對膜彎曲的影響等等。如ESCRT-1蛋白與抑制蛋白(arrestin)直接作用促進微囊泡釋放；細胞發生應激反應時，細胞內鈣水平升高促進微囊泡的釋放；此外，pro-caspase3刺激Rho相關蛋白激酶1促進了凋亡的發生，誘導肌凝蛋白收縮從而釋放微囊泡[6]。

二、EVs內RNA可用于DILI早期診斷

研究發現，非侵入性(尿液和唾液)及微創性(血液)體液來源的EVs可實時反映肝組織的病理變化，其所含物質可作為DILI早期診斷的相關生物標志物。EVs內所含蛋白、RNA或脂類以不同方式參與DILI發生及發展過程，其中microRNA與肝組織炎癥、應激及免疫反應有關[18]。人類白細胞抗原基因型是廣泛藥物發生DILI的危險因素，說明適應性免疫反應在DILI的發生中具有重要作用。發生DILI時，肝細胞來源EVs攜帶受損肝細胞中修飾過的物質透過肝竇進入血液循環，如microRNA-155、高遷移率族蛋白1(HMGB1)以及乙?；腍MGB1在EVs中高表達。肝細胞死亡時，外泌體攜帶損傷相關分子模式(DAMPs)、抗原及細胞因子進入受體細胞，釋放microRNA、mRNA等激活免疫反應，外泌體內microRNA-122及白蛋白mRNA激活單核細胞及成纖維細胞?？梢姼渭毎麃碓赐饷隗w通過釋放肝細胞損傷信號直接或間接參與DILI免疫反應。

炎癥反應在DILI中可造成嚴重的肝組織損傷，炎性反應的嚴重程度與巨噬細胞分化表型明顯相關，大巨噬細胞(THP-1)可分化成M1型或M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞可分泌IL-1β、IL-6、TNF-α及NO合成酶等物質促進炎癥的發生，而M2型巨噬細胞可抑制炎癥的發生、發展。EVs內多種物質可影響THP-1的分化，例如EVs內microRNA-99a抑制THP-1分化成M1型巨噬細胞的同時促進其向M2型巨噬細胞分化[7]。此外，microRNA-106b可促進Th17細胞分化及炎癥因子的釋放，加重肝組織的炎癥反應；microRNA-491-5p可抑制NFκB的表達，減弱NFκB下游信號因子TNF等對肝組織的損傷。研究發現microRNA-223的缺失加重了肝組織中性粒細胞的浸潤、氧化反應及肝毒性。相反，microRNA-223的過度表達明顯減弱了炎癥反應導致的肝組織損傷。體內研究發現，暴露于毒性劑量APAP時可增加微粒子(MPs)及外泌體內mtDNA表達，肝細胞經MPs預處理后，中性粒細胞內microRNA-223表達量顯著增加，然而，敲除toll樣受體9(TLR9)的中性粒細胞microRNA-223則無變化。表明TLR9在中性粒細胞介導的炎癥及肝損傷中具有重要作用。以上研究表明，EVs內所含物質可調節DILI肝組織的炎癥反應，加重或減輕肝組織損傷。

APAP誘導的急性肝損傷小鼠模型中，循環中肝細胞來源的EVs升高明顯早于ALT、AST等肝酶，并且EVs內肝組織特異性microRNA-122及炎癥相關microRNA-155顯著升高。體外評估發現，外泌體形式microRNA比游離狀態更穩定，因此，外泌體形式microRNA可更好地作為DIIL早期診斷的相關生物標志物。相似的，中毒劑量APAP誘導大鼠發生急性肝損傷時，大鼠肝組織發生大量小葉中心壞死， ALT、AST等肝酶顯著升高，肝細胞來源EVs明顯增加，且EVs內肝組織特異性microRNA-122呈倍數增加。肝組織損傷早期，促進抗氧化基因表達的microRNA-298/-370明顯下降，促進了肝損傷的發生。此外，原代肝細胞暴露于APAP 24 h后，肝細胞分泌的外泌體內白蛋白mRNA、microRNA-122明顯增高，而細胞質中microRNA-122無變化。

各類細胞分泌的EVs所含microRNA變化具有組織特異性，APAP誘導的急性肝損傷小鼠模型中，肝細胞來源EVs明顯增加，且肝細胞損傷相關microRNA-122、 microRNA-192及microRNA-155顯著增加，而肌肉特異性microRNA-206或腎特異性microRNA-146a變化很小。急性肝損傷小鼠經抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理后，EVs內microRNA-122、microRNA-192及microRNA-155峰值明顯下降，且可恢復至基線水平，提示NAC幾乎完全阻止了APAP誘導的肝毒性。肝毒性藥物烯丙醇α-萘基異硫氰酸酯誘導大鼠發生肝損傷時，microRNA-122顯著升高，而非肝毒性藥物阿霉素不能使肝源性microRNA-122、microRNA-192表達升高。此外，異煙肼誘導的DILI動物模型中，肝組織特異性microRNA-122表達也明顯增加。體外評估發現，microRNA-122在肝組織的表達量高達72%。肝組織特異性microRNA-122作為肝損傷相關標志物得到廣泛證實。這些結果表明，EVs內microRNA可以作為DILI早期診斷的特異性生物標記物。

肝移植患者發生急性排斥反應時，循環EVs內肝組織特異性microRNA-122/-148a/-194升高明顯早于AST、ALT等肝酶變化。對DILI診斷相關生物標志物進行時間及劑量依賴性分析發現， microRNA-122及谷氨酸脫氫酶(GLDH)變化最早。臨床研究發現，不同肝病患者肝損傷相關microRNA的變化不盡相同，例如microRNA-574-3p /-193a-5p /-148a/ -345在DILI中顯著升高，而慢性丙型肝炎及自身免疫性肝病(AIH)無變化；與健康人群相比，microRNA-345/-483-5p/-193在DILI、慢性乙型肝炎及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中明顯升高。與DILI患者相比，慢性乙型肝炎患者血循環內microRNA-374表達量明顯下降；相似的，與DILI、HBV及NASH患者相比，microRNA-19a/-19b/-266在慢性丙型肝炎患者明顯下降，以上研究表明，EVs內不同肝組織特異性microRNA的變化可作為不同肝疾病診斷的重要生物標志物。[32]然而，microRNA-122的半衰期較短，較其他生物標記物更早恢復到基線值。若明確了APAP暴露后外泌體內microRNA-122變化的時間依賴性，可進一步完善microRNA-122作為DILI早期診斷的價值。

APAP誘導的急性肝損傷大鼠模型中，除microRNA外，循環EVs內肝組織特異性mRNAs也顯著升高，升高的程度與AST、ALT等肝酶呈正相關。EVs內所含物質的變化可更早、更穩定地反映肝組織病理變化。EVs內肝組織特異性mRNA是識別肝損傷更具體、更敏感的生物標記物，如：D-gal誘導的急性肝損傷大鼠模型中，EVs內Alb、Gnb2l 及Rbp4基因的mRNA明顯升高[8]。綜上所述，發生DILI時，EVs內各類RNA可作為DILI早期診斷的生物標志物。

三、EVs內蛋白質及代謝物可用于DILI早期診斷

發生DILI時，肝細胞來源的EVs內蛋白質及代謝物均可發生改變。肝細胞來源的EVs除表達Tsg101、CD63及CD81等外泌體標志蛋白外，也表達肝細胞特異性蛋白質及代謝性疾病相關蛋白質，例如：無唾液酸糖蛋白、膜聯蛋白A2(annexin A2)、對氧磷酶-1(paraoxonase-1)、載脂蛋白E(apolipoprotein-E)、鄰苯二酚O-甲基轉移酶(catechol O-methyltransferase)。細胞色素P450、UDP葡糖醛轉移酶、谷硫代轉移酶及GST等可參與肝細胞對外來化合物的降解，表明肝細胞來源EVs不僅可作為DILI早期診斷的生物標志物，也參與藥物的新陳代謝和清除過程。APAP誘導的急性肝損傷小鼠模型中，肝細胞來源的EVs內肝組織特異性蛋白質表達呈倍數增加。如：肝羧酸酯酶1(CES1)、載脂蛋白A-1(APOA1)、乙醇脫氫酶-1(ADH1)、GST、白蛋白(Alb)、結合珠蛋白(HP)和纖維蛋白原(FGB)。與ALT相比，EVs內蛋白質的變化顯示出對APAP的劑量及時間依賴性。這些結果表明，肝細胞來源的多種蛋白質或蛋白酶能以EVs的形式參與細胞對脂質或外來化合物的代謝。

與對照組相比，原代肝細胞暴露于APAP或雙氯芬酸后，細胞分泌的EVs內多種氨基酸、磷脂及磷酸亞胺代謝物發生了改變。如：L-谷氨酸、α-亞麻酸、十五烷酸及9- 10-二羥基-十八烷酸的表達顯著升高。其中9-10-二羥基-十八烷酸、細胞色素CYP2C、CYP2E1及CYP3A4是亞油酸的代謝產物，支持9-10-二羥基-十八烷酸是肝細胞來源EVs的組成成分[9]。EVs內代謝物的改變可損壞機體的生理功能。例如：嚙齒動物暴露于APAP后，循環EVs內NO酶前體(L-精氨酸)的減少減弱了血管內皮細胞生理功能的維持。相似的，EVs內精氨酸酶的增加誘導了肺血管性高血壓的發生[10]。以上研究表明，肝細胞來源EVs可參與血管內皮調節、氧化還原及能源供應等新陳代謝，促進或抑制DILI的發生、發展。

特異性器官發生損傷時，只有特異序列或選擇性microRNA在EVs內的表達明顯增加。例如順鉑誘導的腎損傷小鼠模型中，尿液來源的EVs內腎損傷分子-1(KIM-1)及中性粒細胞明膠酶相關脂蛋白等腎源性蛋白質明顯增加；環磷酰胺(CPP)誘導的心肌損傷小鼠模型中，循環EVs內心肌特異性肌鈣蛋白(cTnI)明顯升高；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導的神經損傷小鼠模型中，循環EVs內神經特異性蛋白-S100-鈣結合蛋白B(SB)明顯升高。EVs內所含物質具有組織特異性，可作為特異性器官損傷診斷的潛在生物標志物。

線粒體為細胞活動提供能量，是細胞參與抗氧化、脂肪酸氧化、代謝及死亡相關的重要器官。細胞發生各種應激后可釋放線粒體囊泡，線粒體囊泡(MDVs)是由線粒體外膜、內膜及基質中蛋白質選擇性結合生成。MDVs包含II/III/IV型氧化磷酸化復合物，而不包含I/V型蛋白及任何核酸類物質，說明線粒體物質組成的特殊性，氧化反應可誘導蛋白發生構象改變并嵌入MDVs。近期一個報道稱阿霉素誘導心功能發生損傷時，線粒體出現自噬且MDVs數量顯著增加，提示MDVs可能是心肌及線粒體對抗應激反應的第一道防線。線粒體參與多種疾病的發生及發展，然而我們并不知道是否MDVs也參與DILI的發病及進展。因此，線粒體來源的MDVs在DILI中的功能機制需要進一步研究。

四、EVs作為DILI早期診斷生物標志物的優勢與缺點

藥物組學、蛋白質組學及代謝組學促進DILI早期診斷相關生物標志物的發展，研究發現，microRNA、細胞角蛋白18(CK18)及HMGB-1等多種生物化合物參與DILI發生、發展。其中組織特異性microRNA已成為多種器官損傷高度敏感而特異性強的生物標記物。肝組織特異性microRNA-122是DILI早期診斷的重要生物標記物，其中EVs形式microRNA-122價值最大。EVs可反映來源細胞的生理病理狀態，且EVs穩定性強、半衰期時間長等優勢增加了其在DILI中的檢測時間窗。然而，EVs作為疾病診斷的生物標志物仍存在一定的局限性，樣本收集及儲存、分離方法及后續提取RNA缺乏標準方法。目前EVs的分離方法包括離心法、密度梯度法、沉淀法及微濾法等，這些分離方法提取的EVs數量、類型和純度不一致。循環EVs儲存時間過長會增加EVs的破裂及降解；尿液來源的EVs受氯化鈉及丙硫醇晝夜變化的影響，不同時間點提取的EVs所含物質不盡相同。

體內外研究均發現，循環EVs有助于診斷包括DILI在內的多種肝組織損傷。EVs通過調節細胞功能、激活受體細胞不同信號途徑促進或抑制各類肝損傷的發生、發展。然而，由于EVs所含物質多樣化，實驗室環境、條件及分析方法等不同因素的影響，使得EVs缺乏標準化使用方法。目前肝細胞來源的EVs分離主要依賴免疫吸附等非特異性濃縮法，EVs提取方法耗時過長，分離出的EVs質量差。因此，改進不同體液來源EVs的提取方法，分離出可靠、高質量的EVs有助于包括DILI在內的多種疾病的早期診斷，最大化體現EVs應用價值。