肝竇內皮細胞在肝纖維化中的作用

吳玲 李鋒

肝纖維化是慢性肝病發生進展的共同病理生理過程，在持續或反復存在的各種損傷因素作用下，肝內細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的產生與降解失衡而致纖維組織在Disse間隙沉積。

高通透性的肝竇是肝內特殊的毛細血管，其正常的形態及功能對維持肝臟正常的生理功能具有重要作用，持續的損傷導致的肝竇毛細血管化是肝纖維化過程中一個重要的病理過程。作為構成肝竇最主要的細胞，肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC)在肝纖維化過程中的作用備受關注。本文就肝竇內皮細胞在肝纖維化發生中的重要作用予以綜述。

一、LSEC簡述

正常情況下，LSEC是一種缺乏基底膜的高度特化的內皮細胞，即分化型LSEC；受損后，LSEC失去窗孔、發生毛細血管化，成為去分化型LSEC或去窗孔化LSEC。

正常情況下，電鏡下可見窗孔成群聚集成為篩板，并且不同位置的篩板的窗孔數量及大小會有所不同：位于門脈周圍的篩板含有的窗孔數量少但直徑大，而位于肝小葉中央的篩板的窗孔數量多但直徑小[1]；并且，前者更多地表現為CD45陽性，而后者則更多地表現為CD45陰性。因為對于某些細胞表面標志物的表達還存在爭議，如CD31[2]，而且尚未發現分化型LSEC特有的細胞表面標志物，所以目前多用標志物的組合來提示LSEC的存在及分類：同時表達血管內皮生長因子3(vascular endothelia growth factor3，VEGF3)、VEGF受體VEGFR2、鈣黏蛋白及Ⅷ因子的LSEC可認為是分化型LSEC；而表達上調的內皮素-1及表達下調的VEGFR2則可提示LSEC發生毛細血管化[3]。并且，鑒于LSEC的內吞功能，除了細胞表面標志物，胞質內的內吞囊泡也可用來判斷LSEC的存在[1，4]，熒光標記的胚胎硫糖蛋白抗原攝入能力亦可用來檢測分離的LSEC的純度。

電鏡下看到含有窗孔的篩板是檢測LSEC存在的金標準[5]。LSEC許多重要功能，諸如物質交換、血流調節等的有效實現依賴于窗孔的存在[6]；而遭遇損傷后細胞因子、血流動力學的改變、交感及副交感系統的激活等等都會影響LSEC窗孔的數量及大小[7]，若損傷持續，則LSEC發生失窗孔化，繼而出現肝細胞壞死及肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化等，肝內代謝環境失衡，最終導致肝纖維化的出現及進展。因此，分化型LSEC對正常肝功能的維持有著重要的作用，LSEC的失窗孔化是肝纖維化早期的一個重要事件。

二、影響LSEC表型改變的信號通路

(一)基質細胞來源因子1 (SDF-1)肝臟損傷刺激LSEC產生的信號可決定結局是肝臟的修復再生還是進展為纖維化甚至肝硬化[8-9]。當肝臟遭遇損傷后，CXC亞家族的趨化因子—基質細胞來源因子1(SDF-1)受體的表達上調。SDF-1的受體有CXCR7和CXCR4，可產生不同的信號途徑而導致不同的結局。一般在肝臟遭遇急性損傷后，LSEC內CXCR7表達增多，SDF-1與CXCR7結合后，轉錄因子Id1被激活，Id1的激活能夠產生肝再生修復，一般不出現纖維化的修復結局；而在慢性損傷的持續作用下，LSEC的血管生長因子受體1表達上調，與血管生長因子2結合后，持續激活MAPK途徑，誘導LSEC內CXCR4表達而抑制CXCR7的表達，所以在Id1的轉錄被抑制的同時轉化生長因子TGF-β等表達增多，HSC活化，生成大量的ECM而致肝臟纖維化修復。因此，通過改變LSEC受損后傳導的信號將可能改變肝臟的修復結局。

(二)自噬 LSEC的自噬作用對于其特殊表型的維持有重要的作用[10]。當內皮細胞感受到血流動力學變化時，具有保護血管作用的Krupple樣因子KLF2表達上調，增強LSEC的自噬作用而減輕損傷。當自噬作用消失后，LSEC出現功能紊亂，對抗氧應激能力下降，NO產生減少；而NO是維持LSEC分化狀態的重要物質，還能使HSC保持在靜止狀態而減少ECM的產生——LSEC自噬作用的消失會加重肝纖維化[3]。但另一方面，參與脂質代謝的小窩蛋白1(caveolin-1)介導的LSEC的自噬，會激活AMPK-ULK1通路、抑制NO依賴性途徑、重建F肌動蛋白，導致LSEC的去窗孔化[11,12]。因此，不同情況下發生的自噬作用對LSEC的表型具有不同的作用。

(三)Hedgehog(Hh)信號通路 LSEC的去分化過中有Hh信號通路的參與。哺乳動物體內存在的三種Hh蛋白：Shh(Sonic Hedgehog)、Ihh(Indian Hedgehog)、Dhh(Desert Hedgehog)為Hh信號通路中的配體；對Hh信號通路發揮負向調控的Patched(Ptc)和發揮正向調控的Smoothened(Smo)為Hh信號通路中的受體。在無Hh配體的情況下，膜表面的Ptc抑制跨膜受體Smo活性，Hh下游信號通路被抑制，而Ptc與配體Hh蛋白結合后，其抑制Smo作用被解除，Hh下游信號通路激活繼而發生轉錄因子的改變，過度激活的Hh信號通路參與各種疾病的發生。

正常情況下，胚胎發育成熟后的肝臟內Hh配體很少，且LSEC和HSC強表達可與可溶性Hh配體結合而阻止其與Ptc結合的蛋白(Hh相互作用蛋白， Hhip)，所以肝組織內很少存在激活的Hh信號通路；而在肝臟受到損傷后，肝內產生的Hh信號通路的配體增多，如脂毒性常導致激酶JNK(c-Jun氨基末端激酶)的激活而使Shh表達增多[13]。Ptc與配體結合后，Smo活化，LSEC核內的轉錄因子Gli1、Gli2、Gli3激活，Gli蛋白屬于Krupple樣因子家族，一般情況下Gli1增強、Gli3抑制、Gli2既可抑制也可增強Hh基因的表達，活化的SMO在與一系列影響Gli轉錄的物質作用后大多數情況下最終引起Hh信號通路的激活[14]。在非酒精性脂肪肝、肝纖維化等多種病理過程中，出現的DNA甲基化、CpG島的形成、microRNA等調節Hh信號通路，影響著細胞的功能[14]。

所以抑制Hh信號通路可能對肝纖維化的緩解有益。造模膽汁性肝硬化的小鼠在經Hh信號通路抑制劑(維莫德吉)處理后，體內Gli2和CD31表達減少，提示Hh信號通路被抑制；同時LSEC的去分化狀態改善。體外培養的LSEC在2～3 d之內就會發生去窗孔化[5]，而且在LSEC失窗孔化的發生之前Hh信號通路就已激活：在體外培養之前敲除Smo基因，使得發生在去分化之前的Hh信號通路無法激活，LSEC的分化狀態可維持。培養的LSEC發生去分化之后，在通過環巴胺、Hh信號中和劑處理或敲除去分化狀態LSEC的Smo基因來抑制原本被激活的Hh信號通路后，雖然LSEC的去分化標志物iNOS、ET-1等表達下調，但是電鏡下未發現LSEC窗孔的恢復，故抑制Hh信號通路可能只能部分改善已發生去分化的LSEC的表型而不能完全恢復。有研究發現，在四氯化碳處理的小鼠體內的LSEC中的肝臟X受體α(LXRα)表達升高，LXRα可通過抑制Hh信號通路使LSEC保持分化狀態，減輕四氯化碳造成的肝損傷和肝纖維化，LXR激動劑可減緩在肝臟受到損傷后LSEC的失窗孔進程而減輕肝纖維化[15]。

因此抑制Hh信號通路的激活可能成為治療肝纖維化或逆轉肝纖維化的靶點。目前FDA通過的治療基底細胞癌的藥物維莫德吉就是通過抑制SMO而抑制Hh信號通路發揮作用[16]，并且已有動物實驗證明維莫德吉能夠減輕非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝損、血吸蟲性肝硬化小鼠的肝纖維化[17]。另外，具有改善微循環作用的川穹嗪(TMP)也具有抑制Hh信號通路的作用：TMP可減少LSEC內Shh及SMO的表達，抑制Gli1的活性而減少VEGF-A、血小板源性生長因子β受體、缺氧誘導因子HIF-1α等而減少肝臟的血管生成；同時被抑制的Hh信號通路可抑制LSEC的毛細血管化，且體內實驗證明TMP可增加LSEC的窗孔數量而改善LSEC的分化狀態[18]。

三、LSEC與HSC的相互作用

活化的HSC目前被認為是肝纖維化過程中分泌ECM的主要細胞。LSEC與HSC之間的相互作用在維持肝臟正常功能及各種病理過程中起重要作用。

VEGF是調節LSEC與HSC的重要細胞因子。由HSC和肝細胞分泌的VEGF可通過旁分泌途徑作用于LSEC，通過激活LSEC中內皮一氧化氮合酶(eNOS)合成NO，NO進一步通過可溶性鳥苷酸環化酶(sGC)將三磷酸鳥苷(GTP)轉變成環鳥甘酸(cGMP)，通過蛋白激酶G途徑磷酸化靶蛋白，或者蛋白質的巰基亞硝基化等途徑來維持LSEC的分化狀態及各種功能并維持HSC的靜止狀態[1]。LSEC的分化狀態的維持依賴于cGMP途徑即NO依賴性途徑，但同時也存在MAPK等非NO依賴性途徑。分化狀態的LSEC具有維持HSC靜止的功能也是通過NO途徑實現的，而去分化狀態的LSEC則失去維持HSC靜止的功能；當抑制LSEC中的eNOS時，LSEC同樣無法維持HSC的靜止狀態。在慢性損傷持續存在的情況下，sGC激動劑可逆轉LSEC的去分化狀態，分化狀態的LSEC又可通過使活化的HSC凋亡、抑制HSC的活化使得活化HSC的標志物α-SMA減少，ECM合成減少，但是否是完全恢復靜止狀態抑或是僅活化受抑制還需進一步驗證。體外培養時，sGC激動劑可抑制靜止的HSC活化，但無法直接使活化的HSC逆轉為靜止狀態，而需先通過逆轉去分化的LSEC為分化狀態，再間接發揮抑制HSC活化狀態的作用，原因可能是靜止的HSC內存在產生cGMP需要的異二聚體sGC，而活化的HSC內未檢測到這種異二聚體sGC，故無法產生cGMP而無法產生作用[1]。

四、細胞間相互作用

在肝纖維化過程中，LSEC與肝臟其他細胞之間也存在著復雜的相互作用。接受通過LSEC窗孔轉運的營養物質的肝細胞同樣可以分泌VEGF而發揮著影響LSEC表型的作用，TGF-β可刺激LSEC和肝細胞的CD147表達上調，刺激肝細胞的VEGF-A與LSEC的VEGF-R2表達上調，造成LSEC的去窗孔化[19]。LSEC與庫普弗細胞都是肝臟固有免疫系統的重要組成細胞，庫普弗細胞表面的PD-1與LSEC表面的PD-L1相互作用會導致LSEC功能受損[20]。LSEC可通過膜表面表達TGF-β而誘導調節性T細胞(Treg)的產生，減少炎癥及自身免疫性反應的發生，維持肝臟的免疫耐受狀態[21]。

五、小結

肝纖維化的發生是一個涉及多分子、多細胞、多信號通路復雜的過程，LSEC表型的調節及與肝臟細胞之間的相互作用在肝纖維化中發揮著重要的作用，多種受體-配體介導的信號通路參與維持LSEC的去分化狀態并介導其與其它細胞之間的相互作用。