高效氯氰菊酯暴露對小鼠子宮內膜蛻膜化的影響

周永江 方方 李超 高明妃 郭澤莉

摘要：目的? 探討高效氯氰菊酯暴露對小鼠子宮內膜蛻膜化的影響。方法? 將SPF級斷奶昆明雌鼠40只隨機分為對照組和實驗組，每組20只，以灌胃方式染毒90 d。對照組給予玉米油灌胃;實驗組給予10 mg/（kg·bw·d）β-CP+玉米油灌胃。染毒結束后，隨機抽取對照組和實驗組各10只發情期雌鼠分別與雄鼠合攏，次日清晨見陰栓記為孕1 d（D1），于D8 d處死小鼠。各組剩余雌鼠與輸精管結扎的雄鼠合籠建立假孕模型，于假孕第4天（PD4）小鼠宮角注射玉米油。D8和PD8 d摘取小鼠子宮，觀察胚胎著床情況和蛻膜化誘導情況及鏡下觀察子宮內膜厚度。采用RT-PCR和ELISA法分別檢測檢測蛻膜化標志分子dtPRP和BMP2的表達。結果? β-CP暴露降低了小鼠蛻膜化誘導成功率，降低了子宮內膜厚度及dtPRP和BMP2的表達（P<0.05）。與對照組的人工誘導蛻膜化成功率（100.00%）相比，實驗組小鼠的人工誘導蛻膜化成功率（30%）下降，差異有統計學意義（？字2=10.77，P<0.05）。結論? β-CP暴露通過抑制dtPRP和BMP2的表達影響小鼠子宮內膜的蛻膜化，降低了子宮內膜厚度，影響了胚胎著床。

關鍵詞：高效氯氰菊酯;子宮內膜蛻膜化;小鼠

中圖分類號：R114;R711.6;? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.03.020

文章編號：1006-1959（2019）03-0061-04

Abstract：Objective? To study the effect of beta-cypermethrin on deciduation of endometrium in female mice. Methods? 40 female Kunming mice of SPF grade weaning were randomly divided into two groups： control group and contamintated group with 20 each，and were contamintated by the way of lavage for 90 d.The control group was lavaged with corn oil.The contamintated group was lavaged with 10mg/（kg·bw·d）β-CP+corn oil.At the end of contamination， 10 female mice in the control group and 10 mice in the contamintated group were randomly selected to put in a same cage with the male mouse respectively. Early the next morning，Yin suppository was recorded as the first day of pregnancy（D1），and the mice were killed on D8 d.The model of pseudopregnancy was established by putting the remaining female mice in each group and male mice ligated by vasectomy in a same cage.Corn oil was injected into the uterine horn of mice on the 4th day of pseudopregnition（PD4）.The embryo implantation， decidualization induction and endometrial thickness were observed by D8 and PD8 d.The expression of dtPRP and BMP2 were detected by RT-PCR and ELISA，respectively.Results β-CP contamination decreased the success rate of decidualization induction， the thickness of endometrium and the expression of dtPRP and BMP2 in mouse decidua （P<0.05）.Compared with the control group， the success rate of artificial induced deciduation （100.00%） in the experimental group decreased （30%）， and the difference was statistically significant （？字2=10.77， P<0.05）.Conclusion? β-CP contamination affects decidualization of mice endometrium by inhibiting the expression of dtPRP and BMP2，decreases the thickness of endometrium and affects embryo implantation.

Key words：Beta-cypermethrin;Endometrial decidua;Mice

高效氯氰菊酯（beta-cypermethrin，β-CP）作為一種高效、廣譜、速效的殺蟲劑，被廣泛使用[1]。β-CP是從普通氯氰菊酯（cypermethrin，CP）經差向異構得到兩對活性較高的對映體，即順式氯氰菊酯（α-CP）和反式氯氰菊酯（β-CP），β-CP活性比CP高1倍，且對光穩定[2]。因此，其殘留對人體健康的潛在危害不容忽視。β-CP主要用于防治果蔬、茶葉、谷物等作物上的食葉或食果害蟲[3]，因其高殘留性使得β-CP在水、土壤中均有殘留，在許多食材中也檢測出其殘留，如甘藍、青菜、葉用萵苣、芹菜、韭菜、通心菜等[4，5]。最近的一項調查指出在定西地區市售蔬菜擬除蟲菊酯類農藥總檢出率為45.0%，超標農藥主要為氯氰菊酯和β-CP[5]。β-CP具有神經毒性，動物實驗表明可能通過降低多巴胺神經遞質的含量，導致神經毒性[6]。人體接觸中毒后可出現頭疼、頭暈、胸悶、惡心，煩躁、胡言亂語、四肢無力等癥狀[7]。動物實驗顯示，β-CP可破壞雄性小鼠的生精小管并且影響精子的發生，進而造成睪丸組織中精母細胞、支持細胞、間質細胞數量減少，精子畸形[8]。當β-CP作用于雄性大鼠后，體重、顯著降低，睪丸和精囊顯著增大[9]，血清和睪丸中的睪酮、黃體生成素、卵泡刺激素水平發生顯著變化[10]。有研究發現，雌性小鼠孕期接觸β-CP可使雌性小鼠妊娠時間延長，隨著β-CP劑量的增加，小鼠分娩率和平均產仔數均有下降趨勢[11]。處于染毒早期的大鼠受孕率和胚胎著床數減少，死胎增多。β-CP暴露是否會影響子宮內膜蛻膜化了，目前還未見報道。本課題組前期研究發現，β-CP暴露降低了胚胎植入率，使雌鼠的血清雌二醇水平上升、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素的血清水平下降，卵巢結構發生改變，各級卵泡數量隨染毒濃度的增加而減少[12，13]，但未能揭示β-CP暴露是否會對小鼠子宮內膜蛻膜化產生影響。因此，本實驗是在此研究基礎上，通過建立雌性小鼠 β-CP染毒模型對孕期蛻膜化分子標志物dtPRP、子宮內膜厚度的觀察測量以及BMP2的檢測，探索β-CP對子宮內膜蛻膜化建立的影響，為更深入研究其雌性生殖毒性提供實驗依據和理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物? SPF級斷奶昆明雌鼠，購買于長沙天勤生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2014-0011。飼養于海南醫學院科學實驗中心動物房內。動物飼料及墊料購買于長沙天勤生物技術有限公司。所有動物實驗均得到海南醫學院倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑? β-CP（山東西亞化學工業有限公司，Cas號：65731-84-2）;細胞裂解液（碧云天生物技術研究所）;Primers[生工生物工程（上海）股份有限公司];PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit[寶生物工程（大連）有限公司]。

1.2構建β-CP染毒模型? SPF級斷奶昆明雌鼠40只，體重10～15 g， 3周齡，隨機分為對照組和實驗組，每組20只。小鼠進行適應性喂養7 d后，于每天早上9點以灌胃方式染毒，染毒時間設定為90 d;實驗組：灌胃10 mg/（Kg·bw·d）β-CP+玉米油。對照組：灌胃等量玉米油;染毒期間自由進食與飲水，每2 d更換墊料，清洗盒子并對其消毒，稱量體重，記錄攝食量。染毒結束后先對各組小鼠體重稱量并記錄。染毒后進行后續實驗操作。

各組小鼠灌胃溶質和溶劑計算方法：每周1次稱量各組小鼠體重，計算各組小鼠的平均體重值M（g）。依據上述各染毒組濃度結合各組小鼠平均體重計算出各染毒組灌胃溶質量;結合各組小鼠平均體重（g），依灌胃容量為0.01 ml/g計算各組灌胃體積，即溶劑玉米油體積。

1.3建立小鼠體內人工誘導蛻膜化模型? 小鼠子宮內膜自然蛻膜化模型：染毒結束后隨機選取對照組和實驗組各10只雌鼠分別與性成熟雄鼠按3∶1合籠交配，次日清晨見陰栓記為孕第1天（D1），于D8天上午頸椎脫臼法處死小鼠，摘取小鼠子宮，計數小鼠胚泡。小鼠子宮內膜人工誘導蛻膜化模型：染毒結束后隨機選取對照組和實驗組各10只發情期的雌鼠與輸精管結扎的雄鼠也按3∶1合籠交配，次日為假孕第1天（PD1）。PD4小鼠清晨雙側宮角注射玉米油各25 μL，至PD8上午取材。

1.4實時定量PCR檢測dtPRP在小鼠子宮基質細胞中的mRNA表達水平? 刮取D8和PD8雌鼠子宮內膜組織：摘取小鼠子宮，剔凈脂肪和系膜組織，沿子宮縱軸切開子宮，機械刮取內膜組織，PBS清洗3次備用提取RNA檢查dtPRP的mRNA表達水平。提取RNA，反轉錄合成DNA，之后Real-time PCR 法進行定量測定RNA。引物序列為Dtprp：Forward：5'-AGCCAGAAATCACTGCCACT-3';Rerverse：5'-TGA TCCATGCACCCATAAAA-3';β-actin：Forward：5'-GTGGGGCCCCAGGCACCA-3'; 5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。

1.5 ELISA檢測BMP2在小鼠子宮基質細胞中的表達? 取部分小鼠子宮內膜組織于勻漿器中加入胰蛋白酶進行消化，同時進行機械勻漿、分離，收集上清液，采用ELISA法檢測BMP2。測試步驟嚴格按照試劑盒提供的參考方法進行。

1.6統計分析? 實驗數據采用Excel整理，SPSS 22.0軟件進行統計學分析，所有統計圖采用Graph Pad Prism 5.0軟件繪制。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗，計數資料以（%）表示，采用？字2檢驗， P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組小鼠一般情況比較? 染毒期間各組小鼠均無死亡且飲食、行為活動等無異常。染毒后，實驗組小鼠體重低于對照組，差異有統計學意義（t=3.102，P=0.006）。

2.2 β-CP暴露對小鼠子宮內膜蛻膜化的影響? 對照組成功誘導10例，實驗組成功誘導3例，與對照組的人工誘導蛻膜化成功率（100.00%）相比，實驗組小鼠的人工誘導蛻膜化成功率（30.00%）下降，差異有統計學意義（？字2=10.77，P<0.05）。

2.3 β-CP暴露對小鼠子宮內膜厚度的影響 在小鼠子宮內膜自然蛻膜化過程中，實驗組小鼠子宮內膜厚度與對照組相比顯著變薄，且差異有統計學意義（t=9.595，P<0.05）。在人工誘導小鼠子宮內膜蛻膜化過程中，實驗組小鼠子宮內膜厚度與對照組相比顯著變薄，且差異有統計學意義（t=6.544，P<0.05）。人工誘導蛻膜化的實驗組小鼠子宮內膜厚度與自然蛻膜化的實驗組小鼠相比，內膜厚度有所增厚，但差異無統計學意義（P>0.05）。

2.4 β-CP暴露對dtPRP在子宮內膜基質細胞中表達的影響? 染毒后，實驗組dtPRP在子宮內膜基質細胞中表達與對照組相比發生了顯著變化，差異有統計學意義（t=30.762，P<0.05），在自然誘導小鼠子宮內膜蛻膜化過程中，實驗組dtPRP在子宮內膜基質細胞中表達與對照組相比，顯著下調且差異有統計學意義（P<0.05）。染毒后，實驗組dtPRP在子宮內膜基質細胞中的表達與對照組相比發生了顯著變化，差異有統計學意義（t=6.544，P<0.05），在人工誘導小鼠子宮內膜蛻膜化過程中，實驗組dtPRP在子宮內膜基質細胞中表達與對照組相比，顯著下調且差異有統計學意義（P<0.05）。

2.5 β-CP暴露對BMP2在小鼠子宮內膜基質細胞中表達的影響? 在自然誘導小鼠子宮內膜蛻膜化過程中，BMP2在實驗組小鼠子宮內膜基質細胞中表達與對照組相比，表達顯著下調且差異有統計學意義（t=16.133，P<0.05）。在人工誘導小鼠子宮內膜蛻膜化過程中，BMP2在實驗組小鼠子宮內膜基質細胞中表達與對照組相比，表達顯著降低且差異有統計學意義（t=14.111，P<0.05）。

2.6 β-CP暴露對小鼠胚胎著床的影響? 與對照組相比，實驗組胚胎著床數減少，但結果未見統計學差異（P=0.089）。

3討論

子宮內膜蛻膜化是子宮內膜的一種特殊分化過程，與妊娠有著密切聯系。蛻膜化包括子宮腺的內分泌改變、基質細胞的分化、子宮自然殺傷細胞的積聚和血管再生。蛻膜化的子宮內膜間質細胞（endometrial stromal cells，ESCs），在細胞形態和功能上都發生明顯變化，細胞的形態由梭形逐漸變為多角形，胞體大而圓，胞質豐富，細胞間的界線不清[14]，人類子宮內容蛻膜化受多種激素的調節，孕酮誘導子宮內膜基質細胞分化為蛻膜細胞[15]。本研究采用小鼠妊娠D8處死小鼠，獲取子宮組織，這種方法獲得的子宮組織是已經產生蛻膜化的組織，即無需人工激素處理。本實驗結果表明，β-CP暴露小鼠蛻膜化誘導成功率顯著下降，子宮內膜厚度顯著變薄。可能的原因是β-CP影響了dtPRP和BPM2在小鼠子宮內膜基質細胞中的表達，對表達起到了抑制作用。

既往研究報道可采用如注射芝麻油、玻璃珠及子宮劃傷等人工誘導的方法模擬蛻膜化過程，同時檢測標志分子，比如dtPRP、PR、Cyclin D3、PRL、ALP（堿性磷酸酶）等來判斷誘導是否成功[16]。分泌催乳素即（dtPRP），被廣泛認為是ESCs蛻膜化的標志[17]。本研究中，采用了檢測dtPRP 和BMP2在蛻膜化組織的表達。β-CP暴露后，dtPRP在小鼠子宮內膜蛻膜細胞中的表達隨著β-CP暴露染毒劑量的增加而下調。BMP2是BMP/Smads通路的相關基因，是調控成骨的重要通路之一[18]。文獻指出，BMP2能促進人ESCs蛻膜化，當BMP2的表達受到抑制時，將造成不孕和妊娠損失[19]。本實驗中發現，當β-CP下調BMP2在子宮內膜間質細胞的表達時，蛻膜化誘導成功率降低顯著，子宮內膜厚度也顯著變薄。β-CP可能直接或間接的抑制了BMP2在蛻膜組織中的表達。

綜上所述，β-CP暴露顯著降低了dtPRP和BMP2表達，降低了子宮內膜厚度，減少了胚胎著床率。β-CP對雌鼠子宮內膜的蛻膜化進程有干擾作用，但確切的影響機制還有待進一步的實驗研究。

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收稿日期：2018-12-16;修回日期：2018-12-25

編輯/肖婷婷