毛細(xì)管電泳在玉米品種真實(shí)性鑒定中的應(yīng)用

高素偉 張連海 趙新宇

（北京市通州區(qū)種子管理站，北京101117）

目前，北京市各區(qū)縣種子管理站通過田間小區(qū)種植來鑒定品種的真實(shí)性和純度，時(shí)效性較差，也無法提前避免農(nóng)民遭受損失。SSR分子標(biāo)記技術(shù)能夠?qū)Τ闄z的樣品進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)，保證品種的真實(shí)性[1]。毛細(xì)管電泳主要應(yīng)用于肽類、蛋白、核酸、離子和藥物等的分離和測(cè)定，是以高壓電場(chǎng)為動(dòng)力，以毛細(xì)管為通道，依據(jù)樣品中分子量或堿基逐一分開[2]，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品、多個(gè)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)效率。因此，在現(xiàn)有條件下，利用SSR標(biāo)記并結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)對(duì)抽檢樣品進(jìn)行品種真實(shí)性鑒定是提高各區(qū)縣種子站業(yè)務(wù)工作能力，確保種子市場(chǎng)安全的有效方法。

本文利用毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記法對(duì)本轄區(qū)不同門店內(nèi)抽取的6個(gè)玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)，初步判斷品種的真實(shí)性，對(duì)有疑問的樣品提交有資質(zhì)的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)做進(jìn)一步檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料供試材料為2017年3月份從轄區(qū)門店抽取的6份玉米樣品，1：金博士鄭單958；2：金娃娃鄭單 958；3：中字牌鄭單 958；4：德農(nóng)鄭單 958；5：紀(jì)元1號(hào)；6：紀(jì)元1號(hào)。

1.2 基因組DNA的提取將抽檢的6個(gè)玉米樣品進(jìn)行田間種植，在3葉期進(jìn)行取樣，每個(gè)樣品取10個(gè)單株葉片，利用TIANGEN的新型植物基因組DNA提取試劑盒，按照操作規(guī)程提取DNA，并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3引物設(shè)計(jì)參照NY/T 1432-2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標(biāo)記法》推薦的普通玉米真實(shí)性檢測(cè)基本核心引物P01～P20，分別為bnlg439w1、umc1335y5、umc2007y4、bnlg1940k7、umc2105k3、phi053k2、phi072k4、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、phi065k9、umc1492y13、umc1432y6、umc1506k12，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。其中，P14、P18、P11、P15、P20加ROX標(biāo)記；P19、P02、P03、P13、P16加TAMRA標(biāo)記；P09、P05、P01、P12、P10加HEX標(biāo)記；P08、P17、P07、P06、P04加FAM標(biāo)記。

1.3 熒光引物PCR擴(kuò)增熒光引物PCR擴(kuò)增體系：2×Mix 5μL，10μmol/L 的 F/R 0.1μL，DNA 原液 1μL，加 ddH2O 補(bǔ)足 10μL。熒光引物 PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，Tm退火30s，72℃延伸 30s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 30min，4℃保存。根據(jù)引物退火溫度，判斷Tm值，其中P12和P13引物Tm值為55℃，其余18對(duì)引物Tm值為58℃。

1.4毛細(xì)管電泳上機(jī)檢測(cè)取PCR產(chǎn)物0.3μL、分子量?jī)?nèi)標(biāo)（LIZ500）0.5μL和去離子甲酰胺 9.5μL混合加入PCR板中，95℃變性5min，4℃冷卻后離心，1×Buffer緩沖液上機(jī)檢測(cè)，使用DNA分析儀3500XL的片段分析軟件GeneMapper編寫panel，讀出每個(gè)樣品每個(gè)位點(diǎn)的等位基因擴(kuò)增片段大小。當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)≥2時(shí)，判定為不同；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=1時(shí)，判定為近似；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=0時(shí)，判定極近似或相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA完整性檢測(cè)結(jié)果利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)6個(gè)玉米樣品的基因組DNA（圖1），結(jié)果顯示所有條帶均為單一亮帶，并且完整、整齊、清楚，而且點(diǎn)樣孔清晰可見，沒有拖尾現(xiàn)象，表明6個(gè)樣品的基因組DNA質(zhì)量較高，沒有降解，可以繼續(xù)下一步試驗(yàn)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)6個(gè)玉米樣品基因組DNA完整性的結(jié)果

2.2 DNA純度檢測(cè)通常用OD260/OD280比值來衡量樣品DNA純度，質(zhì)量高的DNA，其OD260/OD280的比值在 1.8～2.0之間；OD260/OD280比值 <1.8，表明有蛋白質(zhì)、酚污染；OD260/OD280比值>2.0，表明有RNA污染[3]。由表1可以看出，6個(gè)玉米樣品基因組DNA的OD260/OD280在2.0～2.2之間，有少量RNA污染，但毛細(xì)管電泳的標(biāo)記是針對(duì)DNA設(shè)計(jì)的，特異性很高，而且RNA很容易降解，對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果不會(huì)有影響，因此可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后進(jìn)行毛細(xì)管電泳上機(jī)檢測(cè)。

表1 6個(gè)玉米樣品基因組DNA純度檢測(cè)結(jié)果

2.3 毛細(xì)管電泳上機(jī)檢測(cè)結(jié)果1、2、3、4號(hào)樣品20個(gè)位點(diǎn)差異位點(diǎn)數(shù)=0，不存在差異，說明這4個(gè)樣品為同一個(gè)品種，不存在套牌。由圖2可知，5、6號(hào)樣品的19對(duì)核心引物（P05引物沒有擴(kuò)增產(chǎn)物）擴(kuò)增出來的電泳峰主峰明顯、雜峰較少、峰形整齊，分離效果較好，但在P03位點(diǎn)處存在差異，由此判斷這2個(gè)樣品為相似品種，但不能完全確定是否存在套牌[4]。

圖2 毛細(xì)管電泳檢測(cè)20對(duì)熒光引物在5、6號(hào)樣品基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物

3 討論

本試驗(yàn)利用毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，對(duì)從轄區(qū)門店抽檢的6個(gè)玉米樣品進(jìn)行真實(shí)性鑒定，試驗(yàn)結(jié)果顯示1、2、3、4號(hào)樣品在20個(gè)位點(diǎn)上不存在差異，說明從不同門店抽檢的樣品不存在套牌，為相同品種鄭單958，5號(hào)和6號(hào)樣品均為紀(jì)元1號(hào)，但在20個(gè)位點(diǎn)上存在1個(gè)差異位點(diǎn)，該檢測(cè)結(jié)果與所抽檢樣品不符，但不能完全確定是否存在套牌，為進(jìn)一步確認(rèn)可提交有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)做進(jìn)一步檢測(cè)[5]。這可能是同一個(gè)品種在長期栽培過程中存在自然變異，因此對(duì)育種者來說，保持親本的純度非常重要，在保存親本的過程中除了要從形態(tài)特征上鑒定外還要從分子水平進(jìn)行鑒定，以確保生產(chǎn)的雜交種的真實(shí)性，保護(hù)育種者、生產(chǎn)者及農(nóng)民的合法權(quán)益。