一株牦牛源屎腸球菌對小鼠腸道微生物、形態和免疫功能的影響

楊運南， 楊昌福， 劉亞楠， 羅 璠， 字向東， 高彥華

（青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041）

現代畜牧業正面臨過度依賴抗生素使用而導致的抗生素殘留、細菌耐藥性增強和環境承載力降低等難題（陳振等，2017），益生菌作為飼用抗生素替代物擁有安全、環保等特點。益生菌飼喂動物后，能夠改善腸道形態結構、調節腸道免疫和改善微生物菌群（譙仕彥等，2014；王永等，2013）。因此，益生菌的分離及其功能的研究一直是飼用抗生素替代物研究領域的熱點。

屎腸球菌是一種產乳酸菌（LAB），其在動物體內有調節腸道菌群、腸道形態與黏液層以及腸上皮細胞免疫功能（譙仕彥等，2014）。王永等（2013）研究發現，屎腸球菌可以顯著促進盲、結腸中乳酸桿菌的增殖，并且可顯著抑制仔豬結腸中大腸桿菌的增殖。方偉等（2017）研究發現，添加不同劑量的屎腸球菌對仔豬腸絨毛高度、隱窩深度以及絨毛隱窩比存在不同程度的影響。李雨宸（2015）研究發現，乳酸菌定植腸道后可以增強小鼠上皮細胞抗菌肽Reg3γ的分泌，劉丹等（2008）研究發現，益生菌能明顯降低結腸炎小鼠結直腸黏膜TNF-α的表達。丁爽等（2017）研究發現，屎腸球菌B13可提高斷奶仔豬免疫力和日增重，說明腸球菌作為一種乳酸菌，具有促進動物腸道免疫，改善腸道健康的效果。

本課題組前期在牦牛腸道黏膜中分離出一株高產乳酸菌素腸球菌G2，乳酸菌素效價能為17.47×105IU/mL，并且具有廣泛抑菌活性，對酸具有較強的耐受性（張艷，2013）。目前關于牦牛腸黏膜源益生菌對健康動物腸道菌群、形態和免疫功能的影響研究較少。因此，本研究將以小鼠為研究對象，探討屎腸球菌G2對健康小鼠腸道微生物、形態與腸道免疫功能的影響，為進一步將屎腸球菌G2開發成為益生菌制劑，替代飼用抗生素使用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 屎腸球菌G2由西南民族大學生命科學與技術學院提供，本實驗室保藏。取保種菌液10μL平板劃線，37℃恒溫培養后，挑取單菌落于37℃，200 r/min條件下培養，重復2～3次，至恢復活力。再挑取單菌落于3 mL M17培養基中，37℃，200 r/min培養16～18 h，混勻后得109cfu/mL的屎腸球菌G2菌液。菌液經由80℃水浴60 min滅活，12000 r/min離心2 min去上清，重懸于M17培養基中即得熱滅活菌液。

1.2 試驗動物及飼養管理 7周齡雌性C57BL/6小鼠[體重（18.1±0.470）g，SPF級]24只，購于成都達碩實驗動物有限公司。小鼠飼養于恒溫、恒濕、清潔、無特殊病原體，室溫18～22℃，濕度45%～65%環境中，標準小鼠繁殖料購于成都達碩實驗動物有限公司，試驗期間所有小鼠自由攝入無菌飲用水及飼料，定期更換墊料。隨機分為3個處理組，每組8只，分別為對照組（CON組）、熱滅活菌組（EHK組）與活菌組（ENT組）。CON組、EHK組和ENT組小鼠分別按照0.1 mL/只劑量灌胃M17肉湯、109cfu/mL熱滅活菌液、109cfu/mL屎腸球菌G2菌液。試驗期共計14 d，前7 d為適應期，后7 d為正式試驗期。正式試驗期第1、2、4、6天對小鼠按分組進行灌胃處理，每只小鼠每日9:00灌胃1次，第1、3、5、7天無菌收集小鼠糞便，對糞便乳酸菌總數進行菌落計數。第8天，對小鼠進行屠宰，收集肝臟、脾臟樣品，計算器官指數。收集結腸末端組織樣品、小鼠結腸內容物，液氮速凍，-80℃保存。收集結腸末端樣品，10%中性甲醛固定，用于制作石蠟切片。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 腸道微生物數量 試驗期間收集小鼠糞便，按照GB 4789.2-2010方法對小鼠糞便中產乳酸菌總數進行菌落平板計數。試驗結束后，無菌收集小鼠結腸內容物，用糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP328）提取結腸內容物DNA，采用實時熒光定量PCR法測定腸球菌、乳桿菌和大腸桿菌的數量（高彥華，2014）。引物序列見表1，絕對定量反應體系包括：2×SG fast mix 5.0μL，上游引物0.2μL（10μmol），下游引物0.2μL（10μmol）,模板1μL，加PCR-Grade Water至10μL。定量反應程序：95℃3 min；95℃3 s；退火30 s；40個循環。將Ct值帶入標準曲線計算得到各細菌基因拷貝數。熒光定量PCR標準曲線的建立包含：質粒重組、重組質粒濃度檢測、質粒拷貝數確定、質粒拷貝數與Ct值之間建立線性關系。絕對定量PCR的檢出限為：乳球菌104～1010拷貝，乳桿菌104～1010拷貝，大腸桿菌102～109拷貝。

表1 實時熒光定量引物序列

1.3.2 腸道形態 試驗結束時，斷頸法處死小鼠并稱重。無菌采集小鼠遠端結腸腸段，10%中性甲醛處理過夜，制作蘇木精-伊紅（H&E）染色石蠟切片。按照M.Wlodarska（2011）的方法對切片進行腸道病理學評分，包括對腸腔壞死上皮存在的情況、表面上皮的增生及上皮細胞剝離情況、黏膜杯狀細胞數量及隱窩增生情況和黏膜下層水腫情況進行評定。

1.3.3 腸道免疫因子 腸道抗菌肽胰島再生源蛋白（Reg3γ，Reg3β）、細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、黏蛋白（MUC2）采用實時熒光定量PCR法進行檢測。TRizol法提取小鼠結腸組織RNA，1%瓊脂糖變性凝膠電泳驗證RNA完整性。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）方法反轉錄獲得cDNA。反應體系同1.3.1，采用GAPDH作為內參基因，目的基因及內參基因引物序列見表2。采用2^（-△△Ct）方法計算得到基因的相對表達量。

1.3.4 器官指數 按以下公式計算器官指數與臟器指數：

表2 實時熒光定量引物序列

器官指數=（肝臟重+脾臟重）/體重×100；

臟器指數=臟器重/體重×100。

1.4 數據統計分析 采用SPSS 18.0中One-Way ANOVA對各組之間的差異進行單因素方差分析，采用T檢驗對兩組之間的差異進行分析，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 試驗結果

2.1 屎腸球菌G2對腸道微生物的影響 試驗期間小鼠糞便中乳酸菌總菌平板計數結果顯示（圖1），在試驗的第3、5天，ENT組乳酸菌總菌數量顯著高于CON組與EHK組（P＜0.05），CON組與EHK組菌落數差異不顯著（P＞0.05）。

同時對結腸內容物中腸球菌、乳桿菌和大腸桿菌的數量進行熒光定量PCR檢測，發現各組之間腸球菌、乳桿菌和大腸桿菌的數量（圖2）差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 屎腸球菌G2對小鼠結腸內容物細菌數量的影響

2.2 屎腸球菌G2對小鼠結腸形態的影響 對屎腸球菌G2各處理組小鼠結腸形態的H&E染色切片進行病理學評分，結果見圖3，腸道病理學評分總分各處理組之間差異不顯著。ENT組杯狀細胞數量大于CON組與EHK組，但差異并不顯著（P＞0.05）。CON組隱窩深度顯著小于ENT組（P＜0.05），說明屎腸球菌G2可以顯著影響小鼠結腸隱窩深度。

圖3 結腸病理學評分

2.3 屎腸球菌G2對小鼠器官指數的影響 小鼠器官指數的結果見表3。小鼠器官指數的結果表明，試驗各組器官指數無顯著性差異（P＞0.05）；相同的，小鼠肝臟指數、脾臟指數各組間均不存在顯著性差異（P＞0.05）。

表3 屎腸球菌G2對小鼠器官指數的影響

2.4 屎腸球菌G2對小鼠腸道免疫功能的影響如圖4所示，小鼠結腸抗菌肽Reg3β和Reg3γ基因mRNA表達量各組之間差異不顯著（P＞0.05）。ENT組TNF-αmRNA的表達水平顯著低于CON組（P=0.024），表明灌胃屎腸球菌G2菌液一定程度上有緩解小鼠體內炎癥反應的作用。

圖4 腸道免疫因子的表達

3 討論

3.1 屎腸球菌G2對小鼠腸道微生物的影響 研究發現，益生菌可以影響腸道菌群的組成及其豐度，提高有益菌的含量降低有害菌，其作用途徑主要是菌膜屏障，分泌抑菌素和有機酸以抑制有害菌的生長，與有害菌競爭黏附位點等（譙仕彥等，2014；王永等，2013）。候成立等（2011）研究發現，在斷奶仔豬基礎日糧中添加植物乳酸桿菌可以增加乳酸菌的數量，顯著降低大腸桿菌的數量。方偉（2017）也得到相似結果。董曉麗（2013）研究發現，枯草芽孢桿菌B27對斷奶仔豬糞便中乳酸菌、芽孢桿菌數量無顯著性影響，但大腸桿菌數量顯著降低。本研究發現，對健康小鼠灌胃腸球菌活菌能夠顯著增加小鼠腸道益生菌乳酸菌的數量，但隨著時間的推移，腸道乳酸菌的數量又會回歸到正常水平，結腸內容物中腸球菌、乳桿菌和大腸桿菌的數量沒有顯著改變。以上結果說明，屎腸球菌G2只能在短暫時間內增加腸道益生菌乳酸菌的數量，而對腸道有害菌大腸桿菌的數量沒有影響，這表明屎腸球菌G2符合過路菌的特征，其不具備持續影響腸道菌群結構的能力，即屎腸球菌G2并未在小鼠腸道中定植或并未形成優勢菌群，故對健康小鼠腸道菌群的構成無顯著影響。

3.2 屎腸球菌G2對小鼠腸道形態的影響 研究表明，乳酸菌有助于改善腸道結構，提高動物機體消化和吸收效率。糞腸球菌等乳酸菌能夠降低肉雞的腸道隱窩深度，促進肉仔雞小腸絨毛生長（王利紅，2014；徐基利，2011）。王曉成（2017）研究發現，益生菌能顯著降低小鼠隱窩深度。本研究發現，灌胃腸球菌活菌或熱滅活菌對健康小鼠的腸道病理學方面沒有產生顯著影響，灌胃腸球菌活菌能增加小鼠腸道杯狀細胞的數量，但不存在顯著性。而在結腸隱窩深度方面，灌胃屎腸球菌活菌顯著增加了健康小鼠的隱窩深度。隱窩深度與腸上皮細胞的增殖和凋亡兩個過程的速率有關系。隱窩變深可能是腸上皮細胞增殖速率加快，凋亡速率變慢，使細胞熟度增加、細胞分泌能力增強（王曉成，2017；李雨宸，2015）。因此，屎腸球菌G2有可能會增強腸黏膜上皮的分泌功能。Yan等（2007）研究發現，益生菌產生的可溶性蛋白能間接作用于結腸上皮細胞，抑制上皮細胞凋亡，促進上皮細胞生長，促使隱窩加深。因此，屎腸球菌G2促進小鼠腸道隱窩加深的機理仍有待驗證。

3.3 屎腸球菌G2對小鼠腸道免疫功能的影響肝臟不僅僅是一個消化代謝的器官，還是一個重要的免疫器官，含有豐富的免疫細胞（閆蕾等，2009），脾臟是機體最大的免疫器官，肝、脾器官指數可以反映機體的免疫水平。關于益生菌對動物機體器官指數影響的報道不盡相同，唐志剛（2010）研究發現，肉雞日糧中添加益生菌可以顯著提高肉雞的脾臟指數。朱惠（2016）研究發現，牦牛源腸球菌Swun3對小鼠臟器指數無顯著影響。本試驗結果表明，灌胃屎腸球菌活菌對健康小鼠器官指數、肝臟指數有一定程度的影響但不顯著。造成這一差異的原因可能與試驗所用菌種和施加劑量不同有關。

腸道不僅僅是消化吸收營養物質的器官，同時具有內分泌和免疫的功能（鄒立軍等，2017）。益生菌對腸道免疫因子的分泌有不同程度的影響。腸免疫系統受到刺激后，腸相關淋巴組織能分泌免疫球蛋白、白介素等分子來維持腸道環境的穩態（譙仕彥等，2014）。這其中胰島再生源蛋白（Reg）、腫瘤壞死因子（TNF-α）與黏蛋白（Mucin）在腸道黏膜免疫中發揮著重要的作用。Reg與腸道炎癥的發生有著緊密的聯系（李雨辰，2015）。李雨辰（2015）研究表明，乳酸菌可以增強腸道上皮細胞Reg3γ的分泌，且一定劑量的乳酸菌干預結腸炎小鼠可以緩解小鼠體內的炎癥水平。TNF-α主要由單核-巨噬細胞產生，是典型的促炎因子。黃怡（2012）研究發現，斷奶前仔豬灌服屎腸球菌EF1可以顯著增加空腸黏膜TNF-α表達量，并且能顯著降低回腸黏膜TNF-α的表達量。MUC2由腸道杯狀細胞分泌，是腸道中最豐富的黏蛋白，可以抑制病原微生物的黏附定植（譙仕彥等，2014；楊利娜等，2014）。Reg3β與Reg3γ是小鼠腸道抗菌肽，在炎癥狀態下表達量顯著增加以起到抑制炎性反應的作用。本試驗結果中，灌胃屎腸球菌G2活菌對健康小鼠抗菌肽Reg3β和Reg3γ表達量沒有影響，說明腸球菌G2對腸道無免疫刺激的作用。而促炎因子TNF-α表達量顯著降低，表明腸球菌G2能一定程度緩解炎癥，增強健康小鼠腸道黏膜免疫耐受作用，具備益生特性。試驗處理各組小鼠黏蛋白MUC2表達量不存在差異，這與結果中所涉及的杯狀細胞數量各組差異不顯著的結果相符。綜上所述，牦牛腸黏膜來源屎腸球菌G2能在一定程度上降低健康小鼠腸道炎性反應水平，并具備促進腸道健康的益生效果。結腸抗菌肽Reg3β、Reg3γ和黏蛋白MUC2在短期急性試驗中并沒有表現出明顯的差異，可能屎腸球菌G2在炎癥模型小鼠身上會有較好的益生表現，這方面仍需后續試驗繼續驗證。

4 結論

牦牛腸黏膜源屎腸球菌G2在短期灌胃后能顯著增加小鼠腸道乳酸菌總菌的數量，增加腸黏膜隱窩深度，并降低腸道促炎性細胞因子TNF-α的mRNA表達水平，在一定程度上具有改善腸道形態和促進腸道健康的作用。