肝癌外泌體miRNAs研究進展

王秀芹，路其鳳 綜述，司元全 審校

(山東大學附屬省立醫院臨床醫學檢驗部，山東濟南 250021)

肝細胞癌(HCC)發病率在世界惡性腫瘤中居第5位，病死率位居第3位。我國HCC發病率和病死率分列所有惡性腫瘤的第4位和第3位，其預后差且復發風險高。目前，HCC診斷標志物主要是甲胎蛋白(AFP)和異常凝血酶原Ⅱ(PIVKA Ⅱ)，前者在妊娠生理情況下或重型肝炎、肝硬化等良性疾病患者血清中也會升高。35%～40%的原發性HCC患者血清AFP呈低水平升高，尤其是小HCC，AFP水平升高不明顯，甚至正常[1]。PIVKA Ⅱ檢測結果影響因素較多，如凝血功能異常、肝硬化等均可引起其水平升高，這些因素可能會影響其對原發性肝癌的診斷[2-3]。肝腫瘤切除術、肝移植、介入放射治療和化療栓塞仍是HCC治療的主要選擇。但其預后效果不理想。因此，早期HCC的診斷迫切需要有效的、靈敏的、特異的生物標志物。另外，HCC治療還需更多的、有效的生物療法。有研究表明，外泌體miRNAs在HCC的發生、發展中發揮著重要作用，隨著大量的相關研究成果的陸續出現，可以預見，外泌體miRNAs在HCC診治方面將占有越來越重要的地位。本文總結了近年來外泌體miRNAs與HCC之間關系的研究成果，以期更好地了解其在HCC診治方面的功能和應用。

1 外泌體與外泌體miRNAs概述

外泌體是直徑約為30～150 nm、密度為1.13～1.21 g/mL的小囊泡，包含RNA、蛋白質、miRNA、DNA片段等多種成可分。可存在于血液、唾液、尿液和母乳等體液中，包括腫瘤細胞在內的幾乎所有類型細胞均可產生并釋放外泌體[4]。有研究表明，外泌體參與了細胞間信號傳導，有望在多種疾病的早期診斷中發揮作用。

miRNAs是一類內源性具有調控功能的非編碼RNA，其能與特定的目標信使RNA(mRNA)的3′非編碼區結合，并在轉錄后水平引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，從而對基因進行表達調控。近年來，miRNAs在惡性腫瘤診治方面的應用越來越多[5]。有研究表明，miRNAs不僅可作為HCC診斷和預后評估的敏感生物標志物，且還可用于HCC的治療。外泌體miRNAs較單純miRNAs在檢測和治療HCC方面更靈敏，且其穩定性較miRNAs大得多，因此，其具有更重要的生物學特性。最近有研究表明，外泌體miRNAs參與了HCC的增生、凋亡、抑制等，同時，影響其侵襲、轉移及預后，誘導免疫耐受及耐藥性形成。HCC外泌體可能通過不同種類miRNAs的異常表達間接調控HCC的致病機制，是影響HCC發病的最重要成分之一[6]。

2 外泌體miRNAs在HCC發生、發展中的作用

有研究表明，多種外泌體miRNAs介導腫瘤與腫瘤微環境之間的生物信息傳遞，參與了HCC細胞增殖、轉移、免疫逃逸等進程。

2.1外泌體miRNAs與HCC細胞增殖 miR-122是一種肝臟特異性抗增殖miRNA，將人HCC細胞Huh7和HepG2(miR-122缺陷)共培養后，后者吸收培養液中外泌體miR-122。miR-122可有效抑制HepG2細胞靶mRNA的表達，并降低受體HepG2細胞的生長和增殖速度。且在2種細胞共培養過程中HepG2細胞分泌胰島素樣生長因子1(IGF-1)，減少miR-122在Huh7細胞中的表達。因此，2種不同的HCC細胞之間存在相互影響，且這種相互作用是通過細胞間外泌體介導的miR-122轉移來實現的[7]。HCC患者血清外泌體中的miR-9-3P水平明顯降低，成纖維細胞生長因子5(HBGF-5)在細胞增殖中具有重要作用，后者是miR-9-3P潛在的靶mRNA，miR-9-3p的過表達顯著下調了HBGF-5在mRNA和蛋白水平的表達，進而影響了HCC細胞的存活率和增殖[8]。最近有研究表明，在癌相關成纖維細胞(CAF)衍生的外泌體中miR-320a水平顯著降低。體內外研究表明，miR-320a可通過直接與下游靶——PBX3結合而抑制HCC細胞增殖[9]。miR-142和miR-223存在于巨噬細胞內而HCC細胞內沒有，有研究表明，HCC細胞可攝取巨噬細胞所分泌的含miR-142和miR-223的外泌體，抑制stathmin-1和IGF-1的表達，進而抑制這些癌細胞的增殖[10]。

2.2外泌體miRNAs與HCC轉移 HCC介導的外泌體miRNAs能促進其局部擴散，誘導HCC肝內轉移或多灶性生長。有研究表明，來自HCC細胞的外泌體miRNAs可調節轉化生長因子β活化激酶-1的表達和相關信號傳導，并促進受體細胞的生長和侵襲[11]。在另一項研究中外泌體miR-335-5p在體外抑制HCC細胞增殖和侵襲，并在體內誘導HCC萎縮[12]。有研究表明，遷徙能力強的HCC細胞系的外泌體攜帶大量的miRNAs，可顯著提高非運動性細胞的遷移和侵襲能力[13]。有研究使用丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白刺激肥大細胞后發現，刺激后外泌體內共計19個差異表達的miRNAs，其中miR-490水平顯著提高。后者可增加HepG2細胞miR-490水平，從而抑制ERK1/2通路進而最終抑制HCC的轉移[14]。臨床資料顯示，血清外泌體miR-1247-3P水平與HCC患者肺轉移密切相關[15]。

2.3外泌體miRNAs與HCC腫瘤微環境 腫瘤微環境是指腫瘤的發生、發展與腫瘤細胞所處的內外環境具有密切的關系。腫瘤外泌體是介導局部和遠處微環境中腫瘤細胞和基質細胞之間的細胞間通訊的關鍵介質[16]。CHEN等[17]發現，外泌體miRNAs參與了由環境化學物質引起的HCC癌變過程中的細胞間信號傳導，其中miR-155增強炎性反應，其表達水平與白細胞介素-6(IL-6)和IL-8呈正相關。CAFs作為腫瘤微環境的一個重要組成部分，幾乎與所有癌癥疾病的發展過程相關，而外泌體miRNAs的異常調節促進了CAFs的產生和激活[15,18]。最新研究表明，高轉移的HCC細胞的外泌體miR-1247-3p可促進肺轉移小龕的形成，從而誘導CAFs活化，加速了HCC的肺轉移[15]。ZHANG等[9]分離出CAFs及癌旁相關成纖維細胞(PAFs)發現，miR-320a在CAFs及HCC細胞中表達水平較低，而在PAFs中表達水平相對較高，提示CAFs介導的HCC腫瘤進展與其外泌體中抗腫瘤miR-320a的缺失相關。

3 外泌體miRNAs與HCC診斷、預后評估及治療

HCC一般不易診斷，大多數HCC患者被確診時已處于中晚期。目前，HCC常規治療方式效果不盡理想。因此，早期HCC的診斷迫切需要靈敏的、特異的生物標志物。此外，還需更多有效的治療HCC的生物療法及評估HCC患者預后的生物指標。有研究表明，外泌體miRNAs正是符合這一要求的理想標志物。

3.1外泌體miRNAs與HCC診斷及預后評估 不同外泌體miRNAs在HCC血清或細胞培養液中表達可上調也可下降。有研究發現，HCC患者血清外泌體miR-665水平明顯高于健康受試者。HCC血清外泌體miR-665水平與腫瘤大小、局部浸潤、臨床分期和生存時間均密切相關，血清外泌體miR-665水平越高，患者臨床情況越差，表明血清外泌體miR-665可能是一種用于HCC診斷和判斷預后的新的微創性生物標志物[19]。另外，有研究表明，HCC患者血清外泌體miR-21水平高于乙型肝炎患者和健康對照組，血清外泌體miR-21水平與肝硬化或晚期腫瘤的發生密切相關。盡管血清miR-21具有類似的結果，但檢測靈敏度遠低于血清外泌體miR-21[20]。另一項研究結果顯示，HCC患者血清外泌體miR-18a、miR-221、miR-222、miR-224水平顯著高于慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化患者，但血清相關miRNAs水平在HCC組和對照組之間的差異較小[21]。表明血清外泌體miRNAs與血清循環miRNAs水平相比，能更好地用于HCC的診斷及預后評估。此外，也有研究表明，HCC外泌體miRNAs表達下降，HCC患者血清外泌體miR-101、miR-106b、miR-122、miR-195較CHB和肝硬化患者表達水平顯著降低[21]。另外，HCC患者血清外泌體中的miR-9-3P表達水平明顯低于健康對照組[8]。另一項研究表明，HCC患者血清外泌體miR-638與腫瘤大小、血管浸潤、臨床病理分期呈負相關，外泌體miR-638表達降低常提示HCC患者預后不良[22]。肝移植術后復發的HCC患者血清外泌體miR-718水平較未復發者低，miR-718丟失與HCC預后不良有關[23]。另一項研究表明，HCC血清外泌體miR-125b表達水平與腫瘤數目和病理分期有關，低水平miR-125b HCC患者常伴較短的復發時間和較低的總生存率。外泌體miR-125b可作為評估HCC患者預后的準確、有效的指標[24]。總之，血清外泌體miRNAs可作為判斷HCC患者預后的新的生物標志物。

3.2外泌體miRNAs與HCC治療 外泌體miRNAs相關研究為癌癥治療提供了新的方向，作為一種有效的抗HCC的免疫治療方式，理論上減少了潛在的不良反應。脂肪源性間充質干細胞(AMSC)可穩定產生外泌體，后者表現出有效的免疫活性[25]。miR-122是影響肝臟發育和代謝功能的關鍵因素，其缺失與HCC密切相關[26]。將表達miR-122質粒轉染至AMSC，收集AMSC產生的外泌體(122-EXO)并加入到受體HCC細胞(HepG2)中。結果顯示，miR-122轉染的AMSC能有效產生富含miR-122的外泌體，通過改變HCC細胞中miR-122靶基因的表達而使癌細胞對化療藥物敏感。此外，瘤內注射122-EXO可顯著提高索拉非尼在體內對HCC的抗腫瘤作用[27]。正如前文所述，星狀細胞衍生的外泌體miRNA(如miR-335-5p)可在體內遞送誘導HCC萎縮；CAF衍生的外泌體中miR-320a抑制HCC進展。這均為HCC提供了新的治療方案[9,12]。治療HCC，除直接將抑制腫瘤外泌體miRNAs轉移至HCC細胞外，還可用外泌體miRNAs調節腫瘤微環境。具體而言，CAFs、免疫細胞或腫瘤內皮細胞均可由外泌體miRNAs調控。T淋巴細胞衍生的外泌體miRNAs(主要是miR-92a)可在抗原呈遞細胞中發揮功能，促進免疫應答[28]。調節性T淋巴細胞將外泌體miRNAs轉移至輔助性T淋巴細胞，其中外泌體Let-7d有助于抑制和預防全身性疾病[29]。因此，外泌體miRNAs可作為HCC的潛在免疫治療方式。

4 面臨問題

如前文所述，外泌體miRNAs在HCC診療及預后評估方面均具有重要的應用價值，但也存在一些問題。首先是外泌體提純問題：當前外泌體提純方法(試劑)多種多樣，提取的數量和質量效果均存在差異，目前公認的分離方法依然是超速離心法，但該方法耗時長且缺乏較統一的標準。此外，用于分離外泌體的試劑非常昂貴。因此，建立低成本且節省時間的分離和純化方法是非常必要的。

其次在外泌體miRNAs用于HCC診斷及預后評估方面：對同一種外泌體miRNA不同的研究有不同的結論。一方面是由于研究中所包含的研究對象數量不夠；另一方面是研究對象之間的個體差異較大，導致后續的生物信息學檢測結果也可能發生變化。因此，在分析HCC外泌體miRNAs的差異表達時研究者必須考慮各種因素，如年齡、性別、病毒感染和疾病的所處階段。以后應檢測更多的包括HCC各階段的樣本來提高血清外泌體miRNAs測定結果的可靠性，使其真正成為HCC診斷及預后評估的穩定、準確的生物標志物。

最后在其用于HCC治療方面：正如前文所述，外泌體miRNAs介導的HCC治療首先應保證足夠數量和優質質量的外泌體；此外，將所期望的miRNAs結合到外泌體中仍是一個挑戰。除將表達過量miRNAs的質粒轉染至供體細胞外[27]，也可通過電穿孔方式實現將miRNAs轉至外泌體中[30]；另一個有待解決的關鍵問題是如何提高受體細胞攝取包含所需miRNAs外泌體的能力。相關研究表明，在轉染液泡分選蛋白4A(Vps4A)過表達質粒的SMMC-7721細胞中，6種抑制腫瘤miRNAs顯著上調，Vps4A增強了HCC細胞中外泌體對腫瘤抑制miRNAs的攝取[31]。總之，外泌體miRNAs用于HCC治療前景廣闊，但臨床應用尚有待于進一步研究。

綜上所述，外泌體miRNAs不僅有助于HCC的早期診斷和預后評價，還可作為一種新的治療模式。但目前對外泌體miRNAs的相關研究仍處于探索階段，為更全面地弄清外泌體miRNAs與HCC的關系尚需更深層次的研究。隨著外泌體miRNAs研究的不斷深入，其在HCC的診治及預后評估中將會發揮越來越重要的作用。