多殺菌素粗品精制工藝研究

黃金竹

多殺菌素（spinosad）是由放線菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）發(fā)酵產(chǎn)生的一種大環(huán)內(nèi)酯類高效安全的生物殺蟲劑，其主要活性成分為多殺菌素A（約85%～90%）和多殺菌素D（約10%～15%）;多殺菌素由美國陶氏益農(nóng)公司開發(fā)，因其具有不同于其他各類殺蟲劑的獨(dú)特作用機(jī)理，對(duì)昆蟲的選擇性和對(duì)害蟲綜合治理的適應(yīng)性，能通過多途徑在環(huán)境中被降解以及對(duì)哺乳動(dòng)物、鳥類、水生生物等的低毒性等特點(diǎn)，獲得了美國“總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎(jiǎng)”，已被廣泛用于防治鱗翅目害蟲、小菜蛾、棉鈴蟲、甜菜夜蛾等，同時(shí)對(duì)直翅目、鞘翅目害蟲也有很好的效果。

多殺菌素是親酯性的，在水中溶解度較小，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醋酸丁酯和乙腈等有機(jī)溶劑。目前多殺菌素分離純化的方法主要有溶媒萃取法、柱層析分離法和離子交換法。國內(nèi)對(duì)多殺菌素制備工藝的研究尚未形成高效、高收率的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)，制備的多殺菌素粗品A+D的含量基本在86%左右，其余的是雜質(zhì)，本研究主要通過硅膠柱層析法對(duì)多殺菌素粗品進(jìn)行精制，獲得高純度多殺菌素（A+D）產(chǎn)品，為多殺菌素工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和參考。

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（一）原料、試劑與儀器

多殺菌素粗提物濃縮液（實(shí)驗(yàn)室自制）和對(duì)照品（美國陶氏益農(nóng)公司），高效液相色譜儀（安捷倫），硅膠（200～300目）：青島海洋化工有限公司，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司

（二）方法與過程

（1）硅膠活化。首先將一定量的硅膠裝入搪瓷盤中，放置入烘箱中于110℃活化4h后取出冷卻至室溫，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）多殺菌素粗品制備。多殺菌素發(fā)酵液本實(shí)驗(yàn)室提供，效價(jià)2.3g/L，發(fā)酵液通過樹脂吸附，樹脂脫色，然后進(jìn)行濃縮，石油醚浸提濃縮液，然后用2%酒石酸水溶液反萃取，水相調(diào)pH值在10.0攪拌結(jié)晶得到多殺菌素粗品。

（3）硅膠層析法制備多殺菌素精品。濕法裝柱：量取200mL硅膠，加入正庚烷攪拌至沒有氣泡后緩慢倒入層析柱中，倒入完全后使用洗耳球不斷敲打柱身直至硅膠不在下沉。然后取多殺菌素粗品5g溶解于正庚烷中，加入硅膠柱上面，緩慢流下。

使用1倍柱體積的正庚烷沖洗硅膠柱，后依次以正庚烷/丙酮（2：0.2，2：0.5，2：0.8，2：1）（V/V）進(jìn)行沖洗洗脫，洗脫過程中使用TLC跟蹤檢測，雖然層析柱上有大量顏色被截住了，但是根據(jù)TLC結(jié)果顯示，在正庚烷/丙酮（2：0.5，2：0.8）時(shí)產(chǎn)品洗脫下來，同時(shí)大量雜質(zhì)一同被洗脫下來。合并相同流分，減壓濃縮，濃縮液用正己烷溶解，2%酒石酸水溶液反萃取后調(diào)pH10.0攪拌結(jié)晶，得到純白色粉末。

（4）多殺菌素的HPLC檢測。取粗品和精品分別用甲醇溶解，過濾后進(jìn)行HPLC分析，檢測條件為：C18反相柱;（4μm，8mm×100mm）;流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶水（45∶45∶10，含0.05%乙酸銨;進(jìn)樣量為10μL;流速為1.0mL/min;檢測波長為250nm。根據(jù)多殺菌素A和D組分的積分面積，參照標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算其質(zhì)量濃度，兩組分之和為多殺菌素含量。檢測圖譜如下：（1）粗品，（2）精制品。

二、結(jié)果與討論

多殺菌素發(fā)酵液經(jīng)過初步純化后產(chǎn)品主組分（A+D）的液相檢測純度大約在86%左右，為了提高多殺菌素的純度，采用硅膠柱層析進(jìn)行了進(jìn)一步的精制研究。本研究選用了正庚烷/丙酮為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，最終得到了純度為99%以上的多殺菌素純品，回收率74.8%。

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