腎痿復(fù)方對糖尿病腎病大鼠腎組織MMP-9/TIMP-1表達(dá)的影響

鐘 霞，張宇韋，譚睿陟，樊均明，王 麗

（1西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 646000;2成都醫(yī)學(xué)院）

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，目前已成為終末期腎病(ESRD)最常見的病因。其發(fā)展特點是腎小球基底膜增厚，胞外基質(zhì)蛋白在腎間質(zhì)和腎間質(zhì)區(qū)擴(kuò)增，最后發(fā)展為腎小球硬化、腎間質(zhì)萎縮和纖維化并伴有腎功能障礙。多種生長因子、信號通路以及高血糖都會影響DN 中ECM 的合成和轉(zhuǎn)化率[1]。腎痿復(fù)方是本課題組從“腎痿學(xué)說”角度出發(fā)，以黃芪、三七為君藥制成，具有益氣補(bǔ)腎、活血化瘀的功效。此方已在臨床實踐中應(yīng)用多年，對各種原因引起的慢性腎臟疾病有顯著療效。前期臨床研究表明在西醫(yī)治療基礎(chǔ)上，根據(jù)中醫(yī)辨證論治加入腎痿復(fù)方治療能有效改善糖尿病腎病患者的腎功能，提高患者的生存質(zhì)量[2]。本研究擬通過應(yīng)用腎痿復(fù)方干預(yù)后，觀察實驗組大鼠腎組織中纖維化和金屬蛋白酶指標(biāo)的改變情況，初步探討腎痿復(fù)方防治糖尿病腎病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40 只SPF 級SD 大鼠，SPF 級，雄性，體重（180±20）g，由西南醫(yī)科大學(xué)SPF動物實驗中心提供（許可證：SYXK(川)2013-065）。

1.2 主要藥品、試劑、儀器

腎痿復(fù)方組成（黃芪50 g，三七10 g，當(dāng)歸10 g，懷牛膝30 g，昆布30 g，牡蠣10 g，大黃6 g，丹參15 g，川穹15 g）購自西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院；鏈脲佐菌素（STZ）購自美國sigma公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購于碧云天試劑有限公司（批號：C0105）；AB-PAS 染色試劑盒購于Solarbio 公司（批號：G1285）；ɑ-SMA 抗體購自ebioscience 公司（貨號：14-9760-82）；TGF-β1 抗體購自Cell Signaling Tech?nology 公司（貨號：3711S）；TIMP-1 購自Proteintech公司（貨號：10753-1-ap）；MMP-9抗體購自美國Bio?world Technology 公司（貨號：BS1241）；正置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；全波長酶標(biāo)儀購自美國BioTek Synergy2；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立

40 只雄性SD 大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)為正常對照組、糖尿病腎病組、腎痿復(fù)方低、高劑量組、每組10只，自由飲水和進(jìn)食。正常組大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂養(yǎng)，模型組和實驗組大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，禁食12 h，腹腔注射鏈脲佐菌素（strepto?zoticin，STZ）35 mg/kg(用pH=4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)建立糖尿病模型，正常對照組腹腔注射等容量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。5 d 后大鼠尾靜脈取血，將血糖≥16.7 mmol/L 視為糖尿病造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。模型成功后第2 d開始灌胃，腎痿復(fù)方根據(jù)“動物與人體的公斤體重劑量則算系數(shù)表”換算，既低劑量=正常人每日給藥劑量÷人的重量×6.25，高劑量是低劑量的4倍，連續(xù)灌胃7 d。

1.3.2 標(biāo)本采集

處死大鼠前1 d用代謝籠收集排泄24 h 的尿液，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉（300 mg/kg）將大鼠麻醉，腹主動脈取血，將樣本置于4 ℃的離心機(jī)中3 000 r/min離心10 min分離血清，檢測Crea、BUN 含量。部分腎組織用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、透明及浸蠟包埋后HE和PAS染色法觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化；部分腎組織凍存于-80 ℃冰箱，Western Blot 法檢測相應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 腎組織中α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1 表達(dá)含量測定

稱取0.05 g 腎組織，組織勻漿后測定總蛋白含量，取50 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，經(jīng)PVDF 膜轉(zhuǎn)移后，用5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1一抗（稀釋比例1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3×5 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)二抗（稀釋比例1∶3 000）常溫孵育1 h，TBST 洗滌3×5min后，采用圖像分析系統(tǒng)檢測，結(jié)果以目標(biāo)蛋白/內(nèi)參灰度值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，兩組組間比較采用t檢驗，方差不齊或不服從正態(tài)分布，先將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，若方差仍不齊，則用非參數(shù)檢驗；比較的對象大于兩組時，采用單因素方差分析（One-WayANOVA），P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 一般情況觀察

正常對照組大鼠狀態(tài)良好，飼養(yǎng)期間無死亡現(xiàn)象。糖尿病腎病組大鼠均出現(xiàn)糖尿病典型多飲、多食、多尿、體重下降的表現(xiàn)；與正常對照組相比，糖尿病腎病大鼠出現(xiàn)皮毛無光澤，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，一般活動明顯變差等表現(xiàn)，以模型組表現(xiàn)最為明顯。

2.2 腎痿復(fù)方對糖尿病大鼠生化指標(biāo)的影響

24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮結(jié)果顯示：與模型組比較，腎痿復(fù)方低劑量、高劑量治療組大鼠24h 小時尿蛋白定量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組相比，腎痿復(fù)方高劑量治療組血清肌酐、尿素氮水平均有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮結(jié)果

2.2 病理組織學(xué)結(jié)果

2.2.1 腎臟HE染色結(jié)果

正常對照組大鼠腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，腎小球和基底膜基本正常，系膜區(qū)無增生，腎間質(zhì)無纖維化及炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠可見腎小球體積增大，基底膜增寬，系膜區(qū)明顯增生，出現(xiàn)彌漫性結(jié)節(jié)樣僵硬，結(jié)節(jié)周圍環(huán)形致密物沉積，腎小管上皮細(xì)胞脫落，出現(xiàn)空泡樣變性，管腔明顯擴(kuò)張；腎痿復(fù)方低劑量組、高劑量組大鼠較模型組稍輕，見圖2。

2.2.2 PAS染色結(jié)果

正常對照組大鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)基本正常，腎小球內(nèi)紅染物質(zhì)均勻分布，細(xì)胞外基質(zhì)無堆積，系膜細(xì)胞無增生；模型組大鼠腎小球內(nèi)陽性物質(zhì)及系膜基質(zhì)明顯增多，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，系膜細(xì)胞明顯增生，基底膜節(jié)段性增厚；腎痿復(fù)方低劑量組、高劑量組較模型組病變有不同程度減輕，見圖3。

圖2 腎臟蘇木精伊紅(HE)染色（×400）

圖3 腎臟PAS染色（×400）

2.3 Western Bolt結(jié)果

蛋白免疫印跡法顯示：正常組大鼠腎組織α-SMA、TGF-β、TIMP-1 蛋白水平呈低表達(dá)，MMP9呈高表達(dá)；而糖尿病腎病模型組大鼠α-SMA、TGF-β、TIMP-1蛋白水平顯著增高，MMP9蛋白表達(dá)降低；經(jīng)腎痿復(fù)方干預(yù)后，低劑量組和高劑量組蛋白水平有不同程度改善，其中高劑量組尤甚，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。見圖4。

圖4 各組大鼠α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)差異比較

3 討論

糖尿病腎病已成世界范圍內(nèi)的一個主要健康問題，基礎(chǔ)科學(xué)和臨床治療都進(jìn)行了大量的研究，雖然建立了治療策略,如適當(dāng)?shù)难强刂?血壓控制和抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等干預(yù)措施。盡管實施了這些策略，最終發(fā)展為終末期腎病的糖尿病患者數(shù)量仍然很高。因此，腎功能減退是糖尿病腎病研究的重點領(lǐng)域之一。糖尿病腎病的特征在于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過度沉積和腎小球濾過屏障的破壞。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）影響細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分解和轉(zhuǎn)換，表明MMP的表達(dá)改變可能導(dǎo)致糖尿病腎病[3]。臨床研究表明腎纖維化與長期的損傷和失調(diào)的正常傷口愈合過程與過量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積有關(guān)[4]。基質(zhì)金屬蛋白酶是中性蛋白酶家族的成員，它們在腎小球ECM 降解和周轉(zhuǎn)的過程中起主要生理決定因素。而金屬蛋白酶組織抑制劑-1 作為MMP-9的抑制劑，可與其產(chǎn)生特異性結(jié)合影響糖尿病腎病中ECM的合成和轉(zhuǎn)化率，在腎臟疾病的病理生理學(xué)中起著重要作用[5]。無論損傷類型和病因，腎纖維化通常是進(jìn)行性腎病的最終結(jié)局，并導(dǎo)致正常腎臟結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重破壞和伴隨的功能惡化[6]。TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子-β）被充分鑒定為腎纖維化的中樞介質(zhì)，與糖尿病腎病中纖維化的發(fā)展廣泛相關(guān)。腎小管間質(zhì)纖維化的潛在病理學(xué)的核心是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），或管狀上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。該過程伴隨著許多關(guān)鍵的形態(tài)學(xué)和表型變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞從管狀基底膜分離并遷移到間質(zhì)中。最終，這些細(xì)胞作為活化的肌成纖維細(xì)胞存在，并進(jìn)一步加劇纖維化狀態(tài)。大量證據(jù)支持TGF-β和下游Smad 信號傳導(dǎo)在腎纖維化的發(fā)展和進(jìn)展中的作用，使其逐漸成為慢性腎臟病臨床進(jìn)展的重要生物學(xué)標(biāo)志和治療靶點[7]。

糖尿病中慢性腎病的最佳預(yù)防和治療需要實施特異性干擾糖尿病腎病發(fā)病機(jī)理的療法。糖尿病腎病的核心發(fā)病機(jī)制是虛、瘀、損；治療原則既是標(biāo)本又是虛擬治療，治療方法是補(bǔ)體不足、活血、溫陽補(bǔ)腎；處方有黃芪健中湯、黨骨補(bǔ)血湯等[8]。研究表明黃芪可通過下調(diào)血清肌酐、血尿素氮及糖化血紅蛋白的含量發(fā)揮降低血脂、血纖維蛋白原、血液粘度，改善糖脂代謝，減少尿蛋白，延緩2型糖尿病腎病的癥狀[9-11]。三七及其活性成分可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、減輕炎癥、抗纖維化等途徑在糖尿病腎病中發(fā)揮防治作用[12-13]。臨床研究顯示當(dāng)歸補(bǔ)血湯可改善患者腎功能，調(diào)節(jié)患者細(xì)胞因子和纖維化相關(guān)指標(biāo)如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)等的表達(dá)，具有抑制細(xì)胞因子聚集及延緩腎臟纖維化的作用[14]。當(dāng)歸中藥復(fù)方可改善糖尿病引起的胰島素抵抗和周圍神經(jīng)病變[15]。懷牛膝具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋的作用[16]。小鼠體內(nèi)實驗顯示牡蠣的有效成分牡蠣多糖能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖和吞噬，能夠一定程度提高小鼠臟器系數(shù)和淋巴細(xì)胞增殖能力,提高變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)度，從而發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用[17]。動物實驗表明大黃的主要成分大黃素及大黃酸具有改善腎功能、抑制腎張纖維化的作用[18-19]。丹參具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰之功效，可降低糖尿病大鼠一氧化氮、內(nèi)皮素的含量，對腎組織有顯著保護(hù)作用[20]。臨床研究證明川穹可降低白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-8（IL-8）的水平[21]。

4 結(jié)論

在大鼠DN 模型中，腎痿復(fù)方可能通過調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑比值的失衡，降低α-SMA、TGF-β1表達(dá)水平，改善糖尿病腎臟病理損傷，延緩糖尿病腎病進(jìn)程，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本實驗欠缺之處在于僅選用預(yù)實驗7 天起效的時間點，對血糖的影響還需長時間監(jiān)測，后面有長期實驗進(jìn)一步闡明其作用機(jī)理，為糖尿病腎病的臨床干預(yù)和治療提供新的理論和實驗依據(jù)。