微藻誘變育種的研究進展

□孫仁旺 呂 旭 張紅兵

一、微藻誘變育種

(一)微藻制備原生質體的誘變育種。微藻細胞外存在一層厚厚的細胞壁，對細胞起到很好保護作用的同時，也對紫外線有較強的阻礙。采取復合酶的方法將微藻的細胞壁去除后所得到的原生質體[1]，再進行誘變育種，這便是第一種誘變育種方法。紫外誘變因其操作簡單、效果明顯，國內外學者研究也越多。同時輔助以原生質體誘變技術[2]，增加了微藻對紫外線的敏感程度，使紫外誘變的效果更佳。

1.方法。將微藻細胞在紫外處理之前，按復合酶法去除細胞壁[3]所得到的原生質體薄薄的鋪于已滅菌的培養皿中，迅速放入紫外定時誘變儀中，設置照射距離，并設置不同照射時間梯度，分3個平行組。藻液黑暗放置過夜后，稀釋至合適濃度，細胞壁再生，涂平板，置于光照培養箱，設置光照強度、光照溫度、光照周期等參數進行培養，計算致死率[4]。

2.突變型的篩選。對于耐高溫微藻的篩選，以高溫為選擇培養，簡單、直接且高效。微藻細胞經過紫外誘變，統一做黑箱處理，最終以結果為出發點，不管過程中微藻是否發生了突變、突變是正向還是反向，只要認為以高溫選擇培養的能在高溫環境下存活下來的純培養，即認為是得到了理想的突變型。在此基礎上依據不同指標再評價此次誘變是否理想，與現有相比能否滿足工業生產，再進行分子生物學上的鑒定。后期對突變藻株進行性質研究，如研究生物量或按照已優化的Bligh-Dyer方法測定微藻的油脂含量[5～6]，測定含油量的變化[7]，來加以鑒定。后期通過測定細胞濃度[8]，繪制生長曲線對其進行突變型遺傳穩定性的研究。

(二)微藻直接誘變育種。第二種方法便是直接對微藻進行誘變處理，通過初篩將目的微藻獲得后根據實驗需求直接實驗或制備原生質體實驗等。袁莎[9]做了相關實驗研究，對擬微綠球藻(Nannochloropsis oculata)和日本小球藻(Chlorellahirataii)先進行紫外(Ultraviolet)和EMS誘變，初篩出藻株(UN01、UN16、UN22、EN39、EN57和UC38、EC09、EC24、EC74)，將其作為第一輪改組的親本藻株，進行第二輪基因組改組，按上述方法進行原生質體制備，分別進行種內PEG融合法，在篩選高產性狀藻株，做遺傳穩定分析。

1.微藻的紫外線誘變。分別取對數生長期的藻液平鋪于已滅菌的培養皿中，在距離20W紫外燈照射光源40cm距離下，進行6個不同時間梯度的照射，每組做三個平行樣。照射結束后，黑暗放置培養12h，防止光復性，隨后一并轉移至光照培養箱培養。待第3天后測其死亡率，選取死亡率接近于70%～80%的，確定最佳紫外誘變時間。

2.微藻的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變。取對數生長期的藻液于已滅菌的離心管中，低速離心收集藻細胞，分別加入0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%5個不同濃度的EMS溶液，每組做三個平行樣，懸浮。半小時后加入5%硫代硫酸鈉溶液終止誘變，低速離心去除EMS溶液，無菌水離心兩次，再用已滅菌的新鮮培養基洗滌兩次，黑暗放置培養12h，再轉至光照培養箱培養，待培養一天后測其死亡率，選取死亡率接近于70%～80%的，確定最佳EMS誘變濃度。

3.誘變株的篩選。以產油脂微藻為例，按以上方法所確定出的最佳紫外誘變時間或最佳EMS誘變濃度對產油微藻進行誘變，為防止光復性，先黑暗放置培養12h，再轉移至光照培養箱培養3天。將上述處理培養3天的微藻用已滅菌的液體培養基稀釋涂布(根據實際操作需要)或劃線于已滅菌的固體培養基上，置于光照培養箱中培養。待固體培養基上長出已經肉眼可見的微藻單藻落，用1μg/L的尼羅紅染液染色，先黑暗培養24h,后在熒光顯微鏡下鏡檢觀察染色情況。尼羅紅是一類親脂性的惡嗪類熒光染料，與脂類物質結合在激發波長530nm激發下顯示桔紅色，在紫外照射下顯示紅色，且顏色深淺即熒光強度與脂肪含量呈正相關[10]。尼羅紅染色液先用正己烷定容成0.5mg/ml的母液，再用20%DMSO稀釋1,000倍，過濾膜除菌，在配制實驗所需濃度。鏡檢時將視野中明亮的單藻落用接種環挑取到含有2ml已滅菌液體培養基的離心管中擴培。后期通過將熒光鏡檢篩選得到的藻株連續轉接多代，比較首代與末代的油脂含量，進行遺傳穩定性分析，觀察能否穩定遺傳。

二、微藻誘變育種的研究展望

本文綜述了微藻誘變育種的方法，雖有成功的案例，但迄今為止，基因組改組的應用在范圍和方法上相對比較局限，大部分集中于微生物方面，而在動植物方面進展較少。基因誘變是一個可以獲得生物體的外在復雜表型得到定向進化的功能強大的方法，可以彌補現實中表型較為單一的缺陷，但隨著基因組學、蛋白質組學和分子生物學等學科的發展，越來越多的研究也將被廣泛應用。目前許多已由基因誘變的都是進行蛋白質組學等研究的熱門目標。相信在此基礎之上，伴隨著基因誘變技術的逐漸發展與成熟，蛋白質組學等的同步發展都將會進一步推動生物界的發展，更好地服務于生物界，帶來更多的社會效益。