百色市RABV 野毒株與疫苗株N 基因同源性比對分析

潘懿，霍秀龍，韋顯凱

（1.百色市農業農村局廣西百色 533300；2.平果縣動物疫病預防控制中心廣西百色 531400；3.廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心南寧 530001）

RABV（狂犬病毒）蛋白質占74%，其中N 蛋白占36%[1]，N 蛋白具有五個方面特性：①變異幾率較底，穩定性高；②與病毒免疫直接相關，能刺激機體產生CELL 免疫和體液免疫反應；③保護RABV 在復制過程中免遭破壞；④病毒RNA 從轉錄向復制切換起到重要作用；⑤調節病毒的轉錄與復制的過程。因此，開展N 基因序列檢測對篩選RABV 疫苗毒株具有重大意義。近年來狂犬病病例雖然在全國有所下降，但仍然是傳染病重點防控對象，廣西屬狂犬病主要疫區，百色市是重災區。RABV 主要侵害動物和人的神經系統，95%的病例是被帶毒動物咬傷感染的[2]，因此，對動物狂犬病開展高密度免疫是防控狂犬病主要手段，選擇動物狂犬病疫苗毒株顯得尤為重要。為做好疫苗毒株選擇，本試驗通過分析百色市RABV 流行野毒株與疫苗株N 基因間的差異，最終選定疫苗毒株，為百色市狂犬病防控打基礎。

1 檢測樣品來源

2009-2012 年從百色市12 個縣（市、區）臨床健康犬腦組織標本470 份，寵物門診和農戶散養犬唾液178 份，-20℃凍存送檢。

2 RABV 分離、鑒定和基因序列測定

1）分離、鑒定及PCR 產物回收鑒定等由廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心獸醫實驗室操作完成。

2）RABV N 基因序列分析提取PCR 產物送上海生物公司進行序列測定。

3 RABV N 基因序列、功能區氨基酸序列比對

本次測序共獲得RABV4 株野毒N 基因序列，分別編號為：1號、2 號、3 號、4 號，病毒N 基因核苷酸全長1425bp，測出開放閱讀框為1353bp，推導氨基酸編碼450 個。

3.1 RABV 野毒株與疫苗株N 基因核苷酸、氨基酸同源性比對

Kissi 等[3]提出RABV 分型標準，野毒株N 基因核苷酸和氨基酸序列同源性為88.9%～99.3%和98.4%～99.1%，為基因I 型；1 號與2 號、3 號、4 號菌株核苷酸和氨基酸同源性分別為99.3%和99.3%、88.9%和89.2%、88.9%和89.2%。按照核苷酸和氨基酸同源性分析可分成兩個亞群，1 號、2 號菌株為一個亞群，3 號、4 號菌株為另一個亞群。N 基因野毒株與CTN-1 株、Flur-HEP 株、CVS-11株和ERA 株核苷酸同源性比對驗證結果分別為：89.7%～95.5%、87.4%～88.3%、87.4%～87.9%和87.6%～88.5%；氨基酸同源性比對驗證結果分別為：98.4%～99.1%、98.2%～98.6%、97.3%～98.9%和97.1%～97.3%。野毒株與CTN-1 株核苷酸、氨基酸同源性最高，見表1。

3.2 磷酸化位點389、375 位點比對

表1 RABV野毒株與疫苗株N基因核苷酸、氨基酸同源性比較

磷酸化位點389、375 位與疫苗株保持高度一致。1～4 號野毒株S389 高度保持穩定，T375 與疫苗株保持高度一致[4]。

3.3 N 基因的各個功能區氨基酸序列比對

將已知N 基因5 個功能區182 個氨基酸序列野毒株與疫苗株差異比對。野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為：0.67%～1.11%、0.89%～1.11%、1.11%～2.44%、1.56%～2.22%，野毒株與CTN-1 差異最小，Flur-HEP 株次之，ERA 株差異最大，見表2。

1）維持N 蛋白構型有關的功能區氨基酸序列抗原位點進行比對。疫苗株與野毒株功能區35 個氨基酸序列進行比對，野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA株差異百分比分別為：17.1%、17.1%、22.9%、25.7%，野毒株與CTN-1 株、Flur-HEP 株差異最小，ERA 株差異最大[5]。

表2 野毒株與疫苗株功能區氨基酸序列差異百分比（%）

2）誘導機體產生細胞免疫反應的功能區氨基酸序列抗原位點進行比對。將功能區58 個氨基酸序列疫苗株與野毒比對，野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為：12.1%、12.1%、15.5%、24.1%，野毒株與CTN-1 差異最小，ERA 株差異最大[6,7]。

3）激活體內外Th 細胞的功能區氨基酸序列抗原位點進行比對。激活Th 細胞產生免疫因子相關功能區41 個氨基酸序列比對，野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為：5%、5%、5%、15%，野毒株與CTN-1 株、Flur-HEP 株、CVS-11 株差異最小，ERA 株差異最大[8,9]。

4）促進機體的體液免疫功能區氨基酸序列抗原位點，共30 個氨基酸序列進行比對，野毒株與CTN-1、Flur-HEP、CVS-11、ERA 株差異百分比分別為：0.0%、13.3%、26.6%、13.3%，野毒株與CTN-1株無差異，CVS-11 株差異最大[10]。

4 結論

綜合上述結果，表明百色市目前流行RABV 為基因I 型，可分成2 個亞型毒株，經核苷酸、氨基酸、功能區氨基酸序列和免疫機能有關的功能區氨基酸序列比對，野毒株與CIN-1 株核苷酸、氨基酸同源性最高，親緣性最近，N 基因功能區及免疫機能有關功能區氨基酸序列差異最小，Flury-HEP 株次之，CIN-1 株應是百色地區防控狂犬病首選疫苗毒株。