腫瘤血管生成擬態(tài)的分子病理和影像學(xué)研究進(jìn)展

劉巧遇 綜述 李若坤， 強(qiáng)金偉 審校

血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)的概念由美國(guó)病理學(xué)家Maniotis于1999年首次提出，指腫瘤細(xì)胞通過(guò)自身塑形獲得內(nèi)皮細(xì)胞特性，形成可傳輸血液的管道樣結(jié)構(gòu)，是獨(dú)立于內(nèi)皮依賴性血管(endothelium-dependent vessel)的腫瘤微循環(huán)模式[1]。VM管壁由腫瘤細(xì)胞直接圍繞形成，管腔無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，腔外無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死，腔內(nèi)極少形成血栓[2-4]。VM廣泛存在于黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤中。本文就VM的影像學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

VM的發(fā)生機(jī)制

VM的形成與以下多種機(jī)制相關(guān)：①腫瘤微環(huán)境。腫瘤的快速生長(zhǎng)和血供不足可導(dǎo)致微環(huán)境缺氧，可使缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)1α高表達(dá)[5]。Zhu等[6]將2種卵巢癌細(xì)胞三維培養(yǎng)于缺氧和正常氧環(huán)境中，置于缺氧環(huán)境的卵巢癌細(xì)胞HIF-1αmRNA明顯高表達(dá)，形成VM。Su等[7]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α的抑制劑雷帕霉素可阻止卵巢癌細(xì)胞形成VM。②腫瘤細(xì)胞的“可塑性”。Mourad-Zeidan等[8]發(fā)現(xiàn)高侵襲性黑色素瘤細(xì)胞能發(fā)生表型改變，呈現(xiàn)出多潛能胚胎干細(xì)胞的屬性，從而形成VM。膀胱癌細(xì)胞在三維培養(yǎng)下可形成網(wǎng)狀類血管結(jié)構(gòu)，模擬內(nèi)皮細(xì)胞形成腫瘤微循環(huán)結(jié)構(gòu)[9]。目前研究表明可形成VM的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞同時(shí)也具有某些干細(xì)胞特性，表現(xiàn)出多向分化的能力[10]。③VM形成分子機(jī)制。鈣黏蛋白(VE-cadherin)是促進(jìn)VM形成的重要因子之一，侵襲性黑色素瘤高表達(dá)VE-cadherin，而非侵襲性黑色素瘤陰性表達(dá)[11-12]。VE-cadherin是通過(guò)介導(dǎo)EphA2發(fā)揮作用[13]，EphA2與細(xì)胞膜表面配體互相作用使EphA2磷酸化，之后通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)和黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)激活磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3’-OH kinase,PI3-K),PI3K/Akt信號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜I類基質(zhì)金屬蛋白酶(MT I-MMP)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和5層黏連蛋白γ 2鏈(Ln-5 γ 2)的裂解參與VM的形成。[14]。細(xì)胞組織因子(tissue factor,TF)、半乳凝素3(galectin 3,Gal-3)、環(huán)腺苷酸單磷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)及環(huán)氧酶2(cyclooxygenase 2,Cox2)均與VM的形成有重要關(guān)系[15]。

VM的形態(tài)學(xué)特征

VM是腫瘤細(xì)胞自身變形模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)互相作用形成的類血管樣結(jié)構(gòu)，幾乎只見(jiàn)于高度惡性的腫瘤。VM管壁由腫瘤細(xì)胞直接圍繞形成，管腔無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，腔外無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死，腔內(nèi)極少形成血栓，并少見(jiàn)紅細(xì)胞漏出[16]。VM與內(nèi)皮依賴性血管在免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)上均存在明顯差異。在免疫學(xué)上，VM細(xì)胞外基質(zhì)富含層粘連蛋白、Ⅳ型和Ⅵ型膠原、黏多糖、硫酸肝素糖蛋白等成分，血管內(nèi)皮標(biāo)記物(CD31、CD34、VEGF等)染色陰性，過(guò)碘酸希夫(periodic acid-schiff stain,PAS)染色則呈陽(yáng)性。在形態(tài)學(xué)上，VM特有的管腔結(jié)構(gòu)面積是內(nèi)皮依賴性血管的11.6倍，可為腫瘤獲取更多營(yíng)養(yǎng)；由腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同參與構(gòu)成的血管稱為馬賽克血管，屬于廣義的VM范疇。在結(jié)直腸癌移植瘤中，馬賽克血管直徑10.8 μm ，占所有灌注血管的15%，馬賽克區(qū)域約占所在血管周徑的25%，占整個(gè)腫瘤血管總面積的4%，80%存在基底膜缺如[17,18]。

VM的病理生理學(xué)

VM是腫瘤組織內(nèi)的一個(gè)功能性微循環(huán)，為腫瘤提供豐富的營(yíng)養(yǎng)支持。Maniots等[1]研究葡萄膜黑色素瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)直徑>1cm的瘤體中央無(wú)壞死也無(wú)內(nèi)皮依賴性血管存在的組織學(xué)依據(jù)，但可見(jiàn)大量PAS染色陽(yáng)性的圖案存在，并在該圖案中見(jiàn)到紅細(xì)胞串；經(jīng)葡萄膜黑色素瘤患者的肘前靜脈注入吲哚卡因綠，利用共聚焦激光顯微鏡可見(jiàn)吲哚卡因綠分布于該圖案中。張?jiān)娢涞萚19]將活性炭注入惡性黑色素瘤小鼠模型體內(nèi)，亦可見(jiàn)活性炭顆粒分布于VM結(jié)構(gòu)和內(nèi)皮依賴性血管中央，證實(shí)VM是腫瘤組織內(nèi)的功能性微循環(huán)，這為影像學(xué)檢查時(shí)對(duì)比劑的使用提供了組織學(xué)依據(jù)。

VM的臨床意義

VM與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)。一方面，VM幾乎只存在于高侵襲性惡性腫瘤，如黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等；另一方面，VM豐富了腫瘤組織的血供，并且因無(wú)血管內(nèi)皮的屏障作用，腫瘤細(xì)胞直接構(gòu)成血管壁，更有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Wang等[20]對(duì)86例膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行PAS、CD34檢測(cè)，證實(shí)其中23例含VM血管，VM陽(yáng)性患者的中位生存期(11.17個(gè)月)明顯短于VM陰性患者(16.1個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)，表明VM可能是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素。Shen等[21]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中VM陽(yáng)性率約為24%，VM陽(yáng)性組較陰性組的腫瘤體積更大(>2 cm)(P=0.02)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更常見(jiàn)(P=0.0005)、總體生存期更短(P=0.003)，表明VM與乳腺癌的高侵襲性、不良預(yù)后密切相關(guān)。Williamson等[22]對(duì)41例晚期小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)VM水平越高，總生存率越低(P<0.025)，并且VM可降低腫瘤潛伏期和順鉑的療效。Chen等[23]對(duì)44例肝癌切除標(biāo)本中VM與門靜脈受侵的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)門靜脈受侵患者中VM陽(yáng)性率為72%，陰性率為15%，表明VM與門靜脈受侵呈明顯正相關(guān)(r=0.574,P<0.001)。牛多山等[24]發(fā)現(xiàn)，在156例結(jié)直腸腺癌中VM陽(yáng)性率為20%，在低分化組、伴有血管及神經(jīng)侵犯組、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽(yáng)性率更高，說(shuō)明VM形成與結(jié)直腸腺癌的侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。VM的發(fā)現(xiàn)可能為腫瘤的治療干預(yù)提供新的靶點(diǎn)，因此尋求一種能早期活體定量腫瘤VM存在及數(shù)目的技術(shù)方法對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重大意義。

VM的影像學(xué)評(píng)估

病理學(xué)免疫組化檢查是評(píng)價(jià)VM的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因其有創(chuàng)性、存在取材誤差等局限未能在臨床上廣泛運(yùn)用。影像學(xué)是活體狀態(tài)VM量化評(píng)估的重要方法，可顯示瘤內(nèi)微循環(huán)，為術(shù)前分級(jí)、預(yù)測(cè)靶向治療療效及預(yù)后提供依據(jù)，主要包括超聲、MRI、分子成像、光學(xué)成像等。

1.超聲

趙小琪等[25]利用超聲造影即對(duì)比增強(qiáng)超聲(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)對(duì)裸鼠卵巢癌移植瘤模型進(jìn)行檢測(cè)，比較不同時(shí)間點(diǎn)(21天、28天)腫瘤中VM密度、微血管密度(microvessel density,MVD)及超聲造影參數(shù)[峰值強(qiáng)度(peak intensity,PI)、達(dá)峰時(shí)間(time to peak,TTP)、持續(xù)時(shí)間(time to duration,TTD)]的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)21天組的PI與VM密度、MVD均呈正相關(guān)(r值分別為0.657、0.652，P值均<0.05)，28天組的PI與MVD呈正相關(guān)(r=0.687，P=0.03)。說(shuō)明CEUS定量參數(shù)有助于評(píng)估卵巢癌不同生長(zhǎng)時(shí)期的VM及MVD表達(dá)。Silverman等[26]發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與其特殊的細(xì)胞外基質(zhì)模式相關(guān)，利用高頻超聲波對(duì)117例術(shù)前經(jīng)病理證實(shí)存在特殊細(xì)胞外基質(zhì)模式的黑色素瘤患者進(jìn)行檢查，得出其相關(guān)的聲學(xué)后散射參數(shù)，利用標(biāo)準(zhǔn)波譜分析[分析標(biāo)準(zhǔn)為線性判別分析(LDA)和徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò)(RBN)]，發(fā)現(xiàn)和散射濃度相關(guān)的特征與富含基質(zhì)的模式的組織學(xué)存在相關(guān)，而這種模式又與葡萄膜黑色素瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)有很強(qiáng)的相關(guān)性，故可根據(jù)腫瘤散射濃度的高低早期預(yù)測(cè)瘤體內(nèi)是否存在VM，為臨床治療和疾病預(yù)后提供幫助。

2.MRI

動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI,DCE-MRI)可揭示腫瘤內(nèi)血管分布狀況，量化病變部位的血管生成，為臨床提供病理生理學(xué)信息。龔?fù)萚27]運(yùn)用DCE-MRI評(píng)價(jià)兔VX2骨腫瘤抗血管生成療效，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組VX2骨腫瘤外周區(qū)域與中心區(qū)域的Ktrans值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組治療后腫瘤外周和中心區(qū)域的VEGF表達(dá)、MVD值與Ktrans值間均呈正相關(guān)關(guān)系(r值分別為0.924、0.945、0.848和0.909，P值均<0.05)，表明DCE-MRI可反映腫瘤血管的生成特點(diǎn)。Shirakawa等[28]利用可形成VM血管的WIBC-9腫瘤細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)和MC-5腫瘤細(xì)胞(對(duì)照組)建立裸鼠乳腺癌模型，采用MRI大分子對(duì)比劑行多時(shí)間點(diǎn)MRI動(dòng)態(tài)灌注增強(qiáng)掃描，發(fā)現(xiàn)對(duì)比劑到達(dá)WIBC-9瘤內(nèi)的速度及濃聚速度快于MC-5組，WIBC-9瘤體表現(xiàn)為中央強(qiáng)化程度逐漸增強(qiáng)，且與腫瘤周邊強(qiáng)化程度大體一致；對(duì)照組MC-5表現(xiàn)為中央無(wú)明顯強(qiáng)化。病理上WIBC-9瘤體中央無(wú)血管內(nèi)皮樣結(jié)構(gòu)，也無(wú)明顯壞死及纖維化，電鏡及免疫組化發(fā)現(xiàn)WIBC-9瘤體內(nèi)存在VM-新生血管通路。以上研究結(jié)果表明DCE-MRI可檢測(cè)炎性乳癌中VM血管的存在。

3.分子影像

分子影像學(xué)是將特異性分子探針導(dǎo)入體內(nèi)，通過(guò)影像學(xué)技術(shù)顯示組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的特定分子，反映活體狀態(tài)下分子水平的變化，根據(jù)影像學(xué)參數(shù)對(duì)其生物學(xué)行為進(jìn)行定量、定性分析。Fang等[29]于體外三維條件下培養(yǎng)HCCLM9細(xì)胞96h后，可見(jiàn)該細(xì)胞排列成基質(zhì)骨架，通過(guò)細(xì)胞緊密連接形成管狀、環(huán)形和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即VM，并且利用量子點(diǎn)分子成像可清晰顯示VM。

4.光學(xué)成像

光學(xué)成像(fluorescence imaging,NIRF)是以特定波譜范圍的激發(fā)光源照射熒光分子，被激發(fā)的熒光分子發(fā)出不同光譜特性的光子信號(hào)，此信號(hào)通過(guò)濾光片后由超敏照相機(jī)采集，然后通過(guò)高級(jí)數(shù)據(jù)處理技術(shù)將光子信號(hào)轉(zhuǎn)換為圖像。目前NIRF已較多地應(yīng)用于腫瘤微血管生成研究[30]。Yang等[31]建立裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型，利用全身光學(xué)成像可清晰顯示原位和轉(zhuǎn)移瘤中微血管密度；將表達(dá)熒光蛋白的肺癌細(xì)胞注射入裸鼠爪墊，利用光學(xué)成像發(fā)現(xiàn)腫瘤微血管密度于10 d內(nèi)直線上升；同樣將綠色熒光蛋白陽(yáng)性的人乳腺癌細(xì)胞移植入小鼠乳腺脂肪墊內(nèi)，光學(xué)成像檢測(cè)到腫瘤新生血管密度在20周內(nèi)直線上升，表明光學(xué)成像可實(shí)時(shí)評(píng)估藥物療效和腫瘤新生血管的形成。Camorani等[32]發(fā)現(xiàn)抗表皮生長(zhǎng)因子受體CL4抗體可通過(guò)阻礙整合素α的功能來(lái)抑制乳腺癌中VM的形成，注入特定的IntegriSense成像劑后，通過(guò)熒光分子斷層攝影術(shù)(fluorescent molecular tomography,FMT)進(jìn)行成像研究，CL4-處理組較對(duì)照組而言腫瘤中IntegriSense信號(hào)量減少了48%(P=0.0091)。

光學(xué)層析成像(optical tomography,OT)是根據(jù)生物組織對(duì)光的吸收分布反映組織結(jié)構(gòu)的一種新興的無(wú)創(chuàng)性成像方式。生物組織吸收光能量后產(chǎn)生超聲波，不同組織產(chǎn)生不同強(qiáng)度的超聲波，因此可以區(qū)分正常組織與病變組織。OT對(duì)氧化和脫氧血紅蛋白、脂肪組織和水含量敏感性高，能夠顯示腫瘤血管生成的特點(diǎn)。Quiros-Gonzalez等[33]利用多光譜OT研究雌激素依賴性(MCF-7)與雌激素非依賴性(MDA-MB-231)原位乳腺癌移植瘤模型的血管特征，結(jié)果顯示MCF-7腫瘤含有更多的CD31+/aSMA+的成熟血管，具有更高的VEGF和iNOS，NO血清水平增高，而MDA-MB-231腫瘤中更多見(jiàn)VM，表明OT可以敏感地鑒別乳腺癌血管表型的差異。

VM的發(fā)現(xiàn)豐富了人們對(duì)腫瘤微循環(huán)的認(rèn)識(shí)，解釋了部分抗腫瘤血管生成靶向藥物療效不佳的原因，為腫瘤的治療提供了指導(dǎo)性意見(jiàn)。但關(guān)于VM還有很多問(wèn)題需要研究探索，例如VM與腫瘤內(nèi)皮依賴性血管怎樣相互連接，兩者是否有共同靶點(diǎn)，VM數(shù)量、結(jié)構(gòu)與腫瘤惡性程度的具體關(guān)系。隨著對(duì)VM的深入研究，其解剖、功能、調(diào)控機(jī)制及與腫瘤生物學(xué)行為的相關(guān)關(guān)系都會(huì)逐步明確。