高抗氧化乳酸菌發(fā)酵劑的篩選及其最佳發(fā)酵條件

劉文文，李洋，李鍵，索化夷

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715；2.西南大學(xué) 食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶400715；3.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610041）

0 引 言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。研究表明，乳酸菌發(fā)酵酸奶具有抗氧化[1-12]、降血壓[13]、降膽固醇[14]等功效，市場上功能性乳酸菌酸奶種類日益增加，但其抗氧化功能品質(zhì)卻參差不齊[15]。人工合成的抗氧化劑對機(jī)體有毒副作用，人們越來越關(guān)注天然來源的抗氧化物質(zhì)，如果蔬和酸奶[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)以分離自牦牛酸乳中的22株保加利亞乳桿菌為發(fā)酵劑進(jìn)行體外抗氧化活性測定篩選出具有高抗氧化活性的乳酸菌發(fā)酵劑，通過模擬人體胃腸道環(huán)境對高抗氧化發(fā)酵劑進(jìn)行復(fù)篩，確定最佳抗性菌株，并對其最佳發(fā)酵條件進(jìn)行探究，為研究新型高抗氧化性乳酸菌發(fā)酵乳奠立了基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

二苯代苦味肼基自由基（DPPH，分析純），丁基化羥基甲苯（BHT，化學(xué)純），Tris-HCl（pH=8.2），二乙三胺五乙酸，F(xiàn)eSO4，鄰苯三酚，過氧化氫，抗壞血酸（分析純）。

實(shí)驗(yàn)菌株如表1所示。

表1 從牦牛酸奶中分離鑒定出的22株保加利亞乳桿菌

1.1.2 儀器

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（YX 280A），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082），臺(tái)式恒溫振蕩器（THZ-D），紫外可見分光光度計(jì)（T6新世紀(jì)），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5810R），潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2F），微型漩渦混合器（XW-80A），電子天平（FA2004）。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵劑及發(fā)酵乳的制備

（1）乳酸菌發(fā)酵劑的活化。將22株乳酸菌接種于10 mL液體MRS培養(yǎng)基,于37℃水浴中震蕩培養(yǎng)24 h,所有菌株反復(fù)傳代活化3代。

（2）發(fā)酵乳的制備。將活化三代的22株菌株渦旋搖勻，在無菌條件下各取2 mL培養(yǎng)液于轉(zhuǎn)速為4 000 r/min下離心機(jī)中離心2 min收集菌體。菌體用滅菌生理鹽水洗滌后，以4%的接種量接種于50 mL無菌牛奶中，37℃條件下培養(yǎng)12 h，再以發(fā)酵乳為發(fā)酵劑連續(xù)傳代3次。用無菌槍頭取1 mL已活化三代的發(fā)酵乳于10 mL試管中，加入3 mL滅菌蒸餾水后斡旋搖勻，于轉(zhuǎn)速為4 000 r/min下離心3 min后收集上清液即為提取液。

1.3.2 抗氧化活性的測定

（1）酸奶清除DPPH自由基能力測定。參照文獻(xiàn)[18-19]的方法，測定其DPPH自由基清除率。以不同質(zhì)量濃度（0～0.30 g/L）的維生素C溶液為陽性對照，將不同菌株發(fā)酵酸奶的DPPH自由基清除率轉(zhuǎn)換為維生素C濃度。

（2）酸奶對羥自由基（OH-）清除能力測定。參考文獻(xiàn)[20]中的方法，以維生素C作為陽性對照。

（3）酸奶對超氧陰離子（O2-）清除能力測定參考文獻(xiàn)[21]中的方法，以維生素C作為陽性對照。

1.3.3 乳酸菌的抗性能力篩選

用人工胃液與膽鹽對具有高抗氧化活性的乳酸菌進(jìn)行抗性實(shí)驗(yàn)。

（1）益生菌對人工胃液耐受性的測定。人工胃液的配置：取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的NaCl，0.175 g胃蛋白酶，加50 mL純水溶解后，用濃度為1 mol/L的HCl（8.33 mL濃鹽酸定容到100 mL），調(diào)節(jié)pH值為3.0，在超凈工作臺(tái)中用濾膜過濾，備用。

取5 mL活化好的菌株培養(yǎng)液，在無菌操作臺(tái)中倒入已滅菌10 mL離心管中，經(jīng)3 000 r/min心10 min收集菌體，加入5 mL滅菌生理鹽水混勻制成菌懸液，取1 mL菌懸液與9 mL（pH值為3.0）的人工胃液混合，搖勻，置于恒溫振蕩器中培養(yǎng)（37℃，轉(zhuǎn)速為300 r/min，并分別在0和3 h取樣，用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注37℃培養(yǎng)48 h，用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)，計(jì)算其存活率，即

（2）益生菌對膽鹽的耐受力。將活化好的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫水浴中下靜置培養(yǎng)12 h，按2%接種量分別接種于含0%，0.1%，0.2%，0.3%和0.5%牛膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基中添加0.2%巰基乙酸鈉），在37℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，以未接種的MRS-THIO培養(yǎng)基為空白對照，分別測定不同質(zhì)量濃度培養(yǎng)基在600 nm下的吸光度，按照式（2）計(jì)算乳酸菌對膽鹽的耐受能力[22]。

1.3.4 高抗氧化菌株最佳發(fā)酵條件的確定

表2為L9(34)正交因子水平結(jié)果。

表2 L9(34)正交因子水平

酸奶酸度的測定按GB5009.239—2016計(jì)算酸度。乳酸菌活菌數(shù)的計(jì)算按GB 4789.35—2010計(jì)算乳酸菌數(shù)量。感官評分標(biāo)準(zhǔn)[23]如表3所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

同一樣品平行測定3次，結(jié)果表示為x±SD。應(yīng)用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與作圖，應(yīng)用SPSSDuncan確定數(shù)據(jù)間的差異，差異顯著水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌酸奶清除DPPH自由基能力的測定

DPPH,又稱1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一種以氮原子為中心的大分子自由基，具有很好的穩(wěn)定性，是衡量乳酸菌發(fā)酵乳體外抗氧化活性的重要指標(biāo)之一，發(fā)酵乳對DPPH清除能力越高表示其抗氧化能力越強(qiáng)[24]。由表4可知發(fā)酵乳以及純牛奶對DPPH自由基均有一定的清除能力，但是存在顯著差異，其清除率范圍為33.83%0～75.05%。其中除L14外其余菌株發(fā)酵乳的DPPH清除率均大于未發(fā)酵牛奶對DPPH自由基的清除率。賈亞婷[25]對3株乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵乳進(jìn)行清除DPPH自由基能力的測定，其中動(dòng)物雙歧桿菌發(fā)酵乳BB12的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，為63.12±0.32%，其余2株乳酸菌發(fā)酵乳DPPH清除率分別為52.40%±0.12%，57.60%±0.17%。本研究中，發(fā)酵乳L8，L3，L20均表現(xiàn)出較高的DPPH自由基清除率，分別為75.05%±3.80%，72.22%±1.16%，69.10%±4.39%；其中L8乳酸菌發(fā)酵乳的清除能力最強(qiáng)，相當(dāng)于質(zhì)量濃度為0.1g/L維C的量，且與其他發(fā)酵乳相比差異顯著（P＜0.05)。

表4 乳酸菌酸奶對DPPH自由基的清除率

2.2 乳酸菌發(fā)酵乳對羥自由基清除率的測定

由表5可知，22株乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵的酸乳對羥自由基表現(xiàn)出不同的清除能力，其范圍為28.64%～72.47%，均高于未發(fā)酵的牛乳對羥自由基清除率，這表明發(fā)酵作用使得牛乳的抗氧化活性有所增加，這可能與經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵作用產(chǎn)生的一些活性物質(zhì)如乳酸、多酚有關(guān)。謝海軍[26]對嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、動(dòng)物雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌等不同發(fā)酵劑發(fā)酵的酸乳進(jìn)行了模擬腸道抗氧化活性測定，其中SL+BB12菌株制備的發(fā)酵乳羥自由基清除率最高，達(dá)到58.54%。本研究中，L20，L21，L22發(fā)酵乳對羥自由基清除能力分別為72.47%，71.24%，72.30%；與其他發(fā)酵乳以及謝海軍等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比差異顯著（P＜0.05)。同時(shí)L9菌株發(fā)酵的發(fā)酵乳對羥自由基清除能力較弱，只有28.64%，這說明乳酸菌的抗氧化活性存在菌株差異性，同為保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑，表現(xiàn)出的抗氧化能力也有所不同。

表5 乳酸菌酸奶對羥自由基的清除率

2.3 乳酸菌發(fā)酵乳對超氧陰離子清除作用的測定

由表6可知，22株乳酸菌發(fā)酵乳都具有一定的超氧陰離子自由基清除能力，但清除能力較弱且差異不大，超氧陰離子清除范圍為12.51%～37.38%，但均比未發(fā)酵已滅菌牛乳對超氧陰離子的清除能力強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中，L1、L10、L22這三株乳酸菌發(fā)酵乳的超氧陰離子清除能力都較強(qiáng)，分別為34.38%、33.88%、34.40%，均大于0.2 mg/mL維C的清除率，且與其他菌株差異顯著（P＜0.05)。

試驗(yàn)對22株乳酸菌發(fā)酵乳的抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力不同且差異顯著，L1、L3、L8、L10、L20、L21、L22分別在清除DPPH自由基、清除羥自由基、清除清除超氧陰離子自由基等方面能力突出。將上述菌株作為抗氧化能力較強(qiáng)的乳酸菌在模擬胃腸道環(huán)境中進(jìn)行復(fù)篩。

2.4 乳酸菌的抗性試驗(yàn)

2.4.1 乳酸菌抗人工胃液能力

人體胃液的酸度是一個(gè)不斷變化的過程，但通常都維持在pH 3左右，而益生菌必須要在高酸度的腸胃環(huán)境下保持一定的存活率才能在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用。試驗(yàn)將篩選得到的7株高抗氧化活性乳酸菌繼續(xù)在p H=3的人工胃液中進(jìn)行復(fù)篩。由表7可知，7株菌株中只有L1和L8這2株菌株存活率達(dá)20%以上，其中L1存活率最高為50.81%，與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。劉宏宇等[27]對10株乳酸菌的抗人工胃液能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在p H=3.0的人工胃液中菌株培養(yǎng)3 h后存活率的差異很大，只有其中3株存活率在50%以上，其余菌株基本在人工胃液中不能存活。

表6 乳酸菌酸奶對超氧陰離子的清除率

表7 乳酸菌在人工胃液中的存活率

2.4.2 乳酸菌的抗膽鹽能力

試驗(yàn)分別設(shè)置0.1%、0.3%和0.5%這3個(gè)膽鹽濃度梯度，對7株乳酸菌做了對膽鹽的耐受試驗(yàn)。隨著膽鹽濃度增大，乳酸菌生長效率呈下降趨勢。7株乳酸菌中，L1對膽鹽的耐受力最強(qiáng)在濃度0.3%時(shí)，其生長效率可達(dá)20%以上，為21.02%，膽鹽濃度0.5%時(shí)，L1菌株生長效率為10.23%，其他菌株的生長效率都較差。劉珊春[23]測定19株乳酸菌對膽鹽耐受力時(shí)，膽鹽濃度為0.5%時(shí)，19株菌株的生長效率都小于10%，明顯低于本實(shí)驗(yàn)生長效率。

表8 乳酸菌在膽鹽中的生長效率 %

綜合實(shí)驗(yàn)對22株菌株的抗氧化活性及抗性試驗(yàn)來看，L1菌株為篩選出的高抗氧化性菌株，且在人工胃液與膽鹽中的存活率與生長效率也較高，確定其為目標(biāo)菌株。

2.5 高抗氧化性乳酸菌最佳發(fā)酵條件工藝的確定

2.5.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

在無菌操作臺(tái)里將篩選出的菌株L1接種到已滅菌的牛乳中，按照不同溫度、不同接種量、不同發(fā)酵時(shí)間、不同白糖添加量設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。

表9 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 正交試驗(yàn)趨勢圖

2.5.2.1 4因素對酸度值的影響

由圖1可知，發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳酸度值影響最大，其次是發(fā)酵時(shí)間、白糖添加量與乳酸菌接種量。因?yàn)榘l(fā)酵乳在酸度為70～80°T時(shí)飲用口感最佳，所以其四因素最優(yōu)水平為A3B2C2D3。而發(fā)酵乳酸度值隨著接種量與發(fā)酵時(shí)間的增加出現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這可能是由于無法滿足隨著接種量和發(fā)酵時(shí)間的增加乳酸菌生長對營養(yǎng)物質(zhì)的需求所造成。

圖1 不同發(fā)酵條件對酸度值的影響

表10 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.2.2 4因素對活菌數(shù)的影響

我國《發(fā)酵乳》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，除了發(fā)酵之后熱殺菌的產(chǎn)品外，其余產(chǎn)品要求乳酸菌中活菌數(shù)≥106mL-1。由圖2可知，不同發(fā)酵條件下發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)均到達(dá)標(biāo)準(zhǔn)要求，且最優(yōu)組合為A3B2C2D3。溫度是影響乳酸菌的生長繁殖的重要因素。同時(shí)發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)隨著接種量和發(fā)酵時(shí)間的在增加出現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這可能是由于無法滿足隨著接種量和發(fā)酵時(shí)間的增加乳酸菌生長對營養(yǎng)物質(zhì)的需求所造成。

圖2 不同發(fā)酵條件對活菌數(shù)的影響

2.5.2.3 4因素對感官評分的影響

白糖添加量不同極大地影響了感官評價(jià)，這是因?yàn)殡S著白糖添加量的增加中和了乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸，使得發(fā)酵乳口感更佳的酸甜可口。隨著接種量增加，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生更多的乳酸導(dǎo)致發(fā)酵乳的感官評分有所下降。由圖3可知感官評分達(dá)到最優(yōu)的發(fā)酵條件為A3B2C1D3。

圖3 不同發(fā)酵條件對感官評分的影響

2.5.3 最佳發(fā)酵工藝參數(shù)

由正交試驗(yàn)結(jié)果與趨勢圖得出最優(yōu)組合水平為A3B2C2D3與A3B2C1D3。最優(yōu)水平組合中就只有C（發(fā)酵時(shí)間）因素不同，C因素中兩個(gè)水平里1對感官評分影響較大。感官評分與酸度值及活菌數(shù)綜合比較而言，感官評價(jià)對酸奶總體的影響要大一點(diǎn)，所以選擇組合A3B2C1D3為更優(yōu)工藝條件，即發(fā)酵溫度42℃，乳酸菌接種量4%，發(fā)酵時(shí)間7 h，白糖添加量8 g/mL時(shí)得到的發(fā)酵酸奶呈凝固狀態(tài)無乳清析出、色澤均一、口感細(xì)膩、酸甜適中，具有凝固型酸奶所具有的香味。此時(shí)酸奶酸度79.95oT、活菌數(shù)12.7×106mL－1，感官評分88分。

3 結(jié) 論

高抗氧化型乳酸菌酸奶能幫助人體清除體內(nèi)的自由基，達(dá)到預(yù)防細(xì)胞氧化，增強(qiáng)免疫力的功能。通過對22株保加利亞乳桿菌為發(fā)酵劑的發(fā)酵乳的體外抗氧化活性進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)酵的純牛奶相比，發(fā)酵乳具有更強(qiáng)的抗氧化活性，這說明牛奶經(jīng)過乳酸菌的發(fā)酵作用產(chǎn)生抗氧化活性物質(zhì)，提高了牛奶的抗氧化性能。以保加利亞乳桿菌為單一發(fā)酵劑的發(fā)酵乳對于DPPH與羥自由基具有較強(qiáng)的清除能力，但是清除超氧陰離子自由基能力較弱。本實(shí)驗(yàn)篩選出7株高抗氧化性乳酸菌L1、L3、L8、L20、L21、L22進(jìn)行之后的消化道抗性實(shí)驗(yàn)復(fù)篩，最終確定1株最佳抗性菌株為L1，其DPPH、羥自由基、超氧及超氧陰離子清除率分別為55.07%，65.23%，34.38%，在p H值為3.0的人工胃液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%膽鹽中的存活率分別為50.81%和21.02%。

通過4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)確定L1菌株的最佳發(fā)酵條件為A（發(fā)酵溫度）為42℃，B（乳酸菌接種量）為4%，C（發(fā)酵時(shí)間）為7 h，D（白糖添加量）為8 g/mL。此條件下發(fā)酵乳的酸度值、活菌數(shù)與感官評分總體比較都為最優(yōu)狀態(tài)，再次測得DPPH清除率為58.07%，羥自由基清除率為67.22%，超氧陰離子清除率29.98%，仍具有較高抗氧化活性。