SPE凈化-液質聯用測定氨基糖苷類藥物殘留

2019-03-25 10:57:40陶大利白鶴李琴

中國乳品工業 2019年2期

陶大利，白鶴，李琴

（農業部乳品質量監督檢驗測試中心（哈爾濱），哈爾濱150090）

0 引言

氨基糖苷類抗生素（Aminoglycosides AGs）對革蘭氏陰性和陽性菌均有很好的抑殺作用，屬于廣譜的抗生素[1]。由于這類抗生素具有高效、價廉的特點，是目前在畜牧業、農業、水產養殖業常用的一類獸藥[2]。AGs對人體有較大的毒副作用，許多國家和地區都對此類藥物做出相應要求美國食品藥品監督管理局（FDA）及許多國家和機構針對該類藥物在食品中規定了明確的最大殘留限量[3]，我國在農業部235號公告中也對氨基糖苷類中的部分藥物也有明確的最大殘留限量[4]。

目前有關AGs類藥物檢測的方法主要有微生物法[5]、免疫分析法[6]、儀器分析法[7-8]。特別是液相色-譜串聯質譜技術在AGs藥物檢測中的應用，使其在定性定量的準確度和靈敏度方面都起到了很大的推動作用。本文以新霉素、鏈霉素、卡那霉素、大觀霉素為檢測對象，建立了快速簡便、靈敏度高、特異性強的UPLC-MS/MS的檢測方法。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯質譜儀（ACQUITY UPLC XEVO TQ），配電噴霧離子源，精密電子天平，XS205DU，高速冷凍離心機(sigma 3-30K)，自動固相萃取儀(GX-274),色譜柱(ACQUITY CORTECS HILIC 100mm×2.1mm，1.6μm)，固相萃取柱（WCX 150 mg/6cc），氮吹儀（TS-18821）。

1.1.2 標準品、試劑

硫酸新霉素批號154704質量分數80.0%；硫酸鏈霉素批號157741質量分數90.3%；硫酸卡那霉素批號172706質量分數90.1%；硫酸大觀霉素批號105688質量分數98.0%。

甲醇（梯度級）、乙腈（梯度級）、甲酸（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）、三氯乙酸（分析純）、氨水（分析純），實驗用水為自制的符合GB/T 6682規定的一級水。

1.1.3 標準溶液、試劑配制

提取液：10%三氯乙酸（含0.4mEDTA）,稱取100 g三氯乙酸溶解于1 000 mL水中，再加入0.15 g EDTA。標準溶液準確稱取10～20 mg硫酸新霉素、硫酸鏈霉素、硫酸卡那霉素、硫酸大觀霉素，用一級水溶解并準確定容至100 mL，需按證書含量換算并校正為新霉素、鏈霉素、卡那霉素、大觀霉素的濃度值。4℃避光保存于塑料瓶中（AGs類易與玻璃制品發生吸附）。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣品提取

稱取15 g均質生鮮乳，置于50 mL塑料離心管中，加入10 mL提取液渦旋，超聲波提取5 min,轉速10 000 r/min離心10 min，上清液轉入另一個50 mL離心管中，再用10 mL提取液重復提取，合并兩次上清液，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調p H值到8.0±0.2，用一級水定容至40 mL混勻，再放入離心機轉速10 000 r/min離心10 min，上清液備用。取10 mL上自動固相萃取儀凈化。

1.2.2 樣品凈化步驟

WCX柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，取10 mL上樣，10 mL一級水（分2次加入）淋洗、5 mL甲醇淋洗，用20%甲酸甲醇洗脫，45℃氮氣吹干，用1 mL體積分數為70%的乙腈水溶液，過0.22μm濾膜上機測試。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱為CORTECSHILIC 100×2.1 mm，1.6μm；柱溫為30℃；進樣量為10μL；流動相A體積分數為0.2%甲酸水，流動相B體積分數為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

1.2.4 質譜條件

毛細管電壓：3.00 kV；脫溶劑氣溫度：450℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；碰撞氣（Ar）流量為0.21 mL/min；離子掃描方式：正離子；MRM多反應監測；定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量分析參數如表2所示。

1.2.5 標準曲線繪制

吸取各標準溶液用70%乙腈水配制成50～2 000 ng/mL標準工作曲線，再分別按照1.2.1和1.2.2步驟處理6個基質空白樣品，分別用不同濃度的標準工作液溶解基質過0.22μm濾膜，制成基質標準曲線。

表2 4種氨基糖苷類藥物質譜分析參數

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

本研究選取了4款不同色譜（BEH C18，HSS T3，BEH HILIC,CORTECSHILIC）柱進行了比較，發現目標物在BEH C18和HSST3上幾乎沒有保留，這與氨基糖苷類藥物含有多個氨基和羥基基團而具有較強的極性，無法用非極性較強的反向色譜柱保留有關。在國標[10]和龔強等[11]采用流動相中加入七氟丁酸，通過離子對試劑的疏水性來降低被測目標物的極性，從而實現在反向色譜柱保留。但七氟丁酸對質譜的靈敏度有較大影響，特別是再做ESI-檢測時，儀器的靈敏度影響極大，因此不宜采用。HILIC色譜柱被稱作是一種反反向的作用機理，由于固定相表面無任何鍵合相，氨基糖苷類藥物的極性基團易與硅膠固定相相結合，分析過程有較強的保留，由于CORTECSHILIC色譜柱比BEH HILIC色譜柱的粒徑更小，分離的峰更尖銳，所以本研究采用CORTECS HILIC色譜柱。

2.1.2 流動相的優化

由于CORTECSHILIC的作用機理與反向C18相反，當流動相中有機相比例大時，目標物在色譜柱上保留就強，隨著水的比例的增加，實現目標物與干擾物的分離，目標物可以逐一的洗脫下來。本研究實驗了有機相選用甲醇和乙腈，水相選用水、甲酸水溶液、甲酸銨水溶液，實驗發現使用乙腈比甲醇的靈敏度更高，在水相中王帥兵等[12]、劉雪紅等[13]采用高濃度甲酸銨（200 mmol/L）做流動相，經過測試發現高濃度的甲酸銨會使目標物產生很強的離子抑制現象，4種目標物的靈敏度很低，同時卡那霉素和新霉素嚴重拖尾，不能滿足測試要求；通過對流動相的優化，發現降低緩沖鹽濃度會使靈敏度逐漸升高，峰形逐漸改善，通過實驗在0.2%甲酸水和0.1%甲酸乙腈的條件下，靈敏度最佳、峰形對稱。4種物質MRM（質量濃度800 μg/L）譜圖如圖1所示。

2.2 樣品前處理的優化

2.2.1 樣品的提取

由于氨基糖苷類藥物易溶于水，而不易溶于有機試劑，所以樣品的提取宜采用水或含鹽的水溶液，大量文獻中采用三氯乙酸溶液提取，生鮮乳基質復雜，含有大量的蛋白質和脂肪，通過實驗發現三氯乙酸對生鮮乳中目標物具有良好的提取效率，同時利用其酸性可以有效的沉淀蛋白質和脂肪，獲得澄清的溶液，為下一步的凈化提供條件。

2.2.2 樣品的凈化

為滿足質譜檢測的要求，降低檢測的干擾和防止質譜的污染，本方法采用固相萃取的方法對樣品凈化，通過參考文獻，選取C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱、WCX固相萃取柱進行試驗，在使用C18和HLB固相萃取柱的試驗中為增加目標物在固相萃取柱中的保留，樣液中添加七氟丁酸和庚烷磺酸鈉離子對試劑，測試發現4種目標物回收率仍然不足50%；而WCX固相萃取柱是弱陽離子固相萃取柱，可以通過改變溶液的PH值使固定相帶電荷和不帶電荷來實現對強堿性物質（氨基糖苷類藥物）的吸附和洗脫，從而實現樣品的凈化，具有高度的選擇性。在洗脫步驟中戴輝[14]等用5%甲酸甲醇洗脫，劉雪紅[13]等用10%乙酸甲醇洗脫，本研究考察了洗脫液中甲酸體積分數對洗脫效果的影響，分別用體積分數5%，10%，15%，20%，25%甲酸甲醇溶液洗脫，使用量為5 mL，繪制回收率的趨勢如圖2所示。由圖2可以看出，當甲酸過低時不足以將目標物洗脫完全，當甲酸的量達到20%以上時回收率趨于穩定，但甲酸的沸點為102℃，過多的甲酸給氮吹帶來困難，所以甲酸的使用量不宜過大，本文選用質量分數為20%甲酸甲醇做洗脫液。

圖1 4種氨基糖苷類藥物標準溶液（MRM）色譜

圖2 不同體積分數濃度甲酸甲醇對回收率趨勢圖

2.3 方法的線性關系與定量限

用空白基質配制的4種氨基糖苷類藥物的標準曲線，鏈霉素、卡那霉素、大觀霉素質量濃度分別為50，100，200，500，1 000，2 000 ng/mL；新霉素質量濃度為100，200，500，1 000，2 000，4 000 ng/mL。以質量濃度為橫坐標，以目標物峰面積為縱坐標繪制標準曲線，鏈霉素、卡那霉素、大觀霉素質量濃度在50～2 000 ng/mL之間，新霉素質量濃度在100～4 000 ng/mL之間線性關系良好，相關系數均在0.99以上。以定量離子信噪比大于3計算檢出限，以信噪比大于10計算定量限，鏈霉素、卡那霉素、大觀霉素檢出限為10μg/kg，定量限為20μg/kg，新霉素檢出限為20μg/kg，定量限為40μg/kg。