循環腫瘤細胞在結直腸癌臨床診療中的應用

謝禮鋒， 陳鴻源， 許 超(綜述)， 薛芳沁(審校)

結直腸癌高發于發達國家和地區，但隨著我國經濟的發展和城市化的進程加快，居民飲食結構和生活習慣的改變，近年來，我國結直腸癌的發病率和死亡率均呈上升趨勢[1]。結直腸癌是造成全球疾病負擔的第三大腫瘤，發病率僅次于肺癌和乳腺癌，嚴重威脅居民健康[2]。隨著結直腸癌的診斷方法、手術技巧及治療方案的不斷優化，患者的預后得到一定程度的改善。手術切除是結直腸癌的主要治療手段，但復發和轉移是導致預后不良的重要因素[3]。研究表明，腫瘤的遠處轉移與血液中存在的循環腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)形成的微轉移密切相關[4]。1869年，Ashworth教授首先提出了CTC的概念，CTC是指自發或因診療操作由實體腫瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的游離腫瘤細胞，進入循環后未被清除的腫瘤細胞通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，最終發展為轉移灶[5]。CTC具有與原發腫瘤病灶高度相同的腫瘤特異性抗原和基因學特征，具有極高的腫瘤特異性，可用于惡性腫瘤疾病的體外“液體活檢”[6]。目前，依賴影像學和腫瘤標志物的檢查，難以發現早期腫瘤的生長，而檢測外周血中的CTC快捷無創，對于早期發現腫瘤、動態監測療效和評估預后等都具有極高的臨床應用價值。

1 CTC的富集和分析

1.1CTC的富集與分離 CTC在腫瘤患者的外周血中數量極少，每10 mL的血液中僅有幾個至十幾個[7]，需要先將外周血中的CTC進行分離和濃縮，以提高檢測的靈敏度。目前，CTC的富集和分離主要是根據物理學和免疫學特征將其從外周血細胞中篩選出來。基于CTC的物理特性，例如細胞大小、密度和電學特性；基于抗原抗體特異性結合反應的免疫富集方法，包括正向富集和負向富集兩種。

1.1.1基于CTC的物理學特性 研究表明，腫瘤細胞的直徑為15～25 μm，而白細胞直徑為8～14 μm，根據細胞直徑的不同，利用具有一定大小的濾過膜可以將直徑較大的CTC富集分離出來[8]。基于外周血的各種細胞密度差異產生不同的細胞沉降系數，紅細胞、白細胞和腫瘤細胞的相對密度分別為1.092，1.065和1.056[9]。利用密度梯度離心法，將外周血中不同密度的細胞組分進行分離。Rosenberg等運用此法對CTC進行富集，發現結直腸癌患者外周血的CTC陽性率為41%[10]。該方法對設備的要求不高，操作較為簡單，但易導致缺乏相應密度的腫瘤細胞丟失。不同細胞具有不同的電學特性，在電場中，這些細胞產生的電偶極距大小和方向存在差異，利用其受到的力學作用不同，將目的細胞分離出來。利用電學原理在血液中捕獲腫瘤細胞的效率可達70%[11]。基于細胞物理學特性富集的CTC細胞形態保存完整，細胞表面的各種抗原或分子均未被破壞，簡單且易于操作，但靈敏度較低。

1.1.2基于CTC的免疫學特性 外周血腫瘤細胞免疫富集的方法是基于抗原抗體特異性結合的原理，分為正向富集和負向富集兩類。正向富集是針對CTC表面表達的特異性腫瘤細胞抗原，如EpCAM，利用帶有標記的外源性EpCAM抗體與之結合，從而達到CTC的直接捕獲和富集。近年比較常用的Cell Search系統就是基于免疫磁珠法進行正向富集，也是目前唯一一個獲得FDA批準上市的產品。此外，還有磁珠分選系統MACS(Miltenyi Biotec Gmb H)和Mag Sweeper系統[12-13]，其CTC的富集特異度大大提高。在提高檢出特異度的同時，為了避免檢出敏感度的下降，Adna Test采用了含多種抗體的免疫磁珠對CTC進行分選。反之，負向富集的的靶點則是白細胞表面的抗原，例如CD45，利用外源性CD45抗體結合白細胞后，將白細胞篩除，從而達到去除背景血細胞而富集CTC的效果。Easy Sep?系統(Stem Cell)就是采用CD45免疫磁珠對外周血腫瘤細胞進行富集，其陽性率約64%[14]。負向富集的方法不依賴CTC表面特異性抗原，具有通用性，適用于各種腫瘤細胞樣本，但其富集純度較低。近年，基于微流體芯片的免疫吸附法也開始應用于科研和臨床[15]，其原理類似于免疫磁珠法，微柱狀陣列結構表面上包被的EpCAM抗體與流過的外周血中CTC相結合，達到截留富集目的。

1.2CTC的檢測與分析 CTC的檢測分析方法分兩大類：細胞計數法和核酸檢測法。前者主要包括免疫細胞化學法和流式細胞術等，后者主要包括聚合酶鏈式反應和逆轉錄聚合酶鏈式反應等。免疫細胞化學法以顯色劑標記的特異性抗體進行細胞原位抗原抗體反應和化學呈色反應，對相應腫瘤抗原可進行定性、定位和定量測定，但敏感性不高。流式細胞術是一項集激光、電子物理、光電測量、計算機、細胞熒光化學及單克隆抗體技術為一體的新型技術，定量計數腫瘤細胞，數據精確，還可對細胞進行多參數分析，但價格昂貴、耗時較長，限制了該技術在臨床中的廣泛應用[16]。PCR技術檢測腫瘤患者外周血中的CTC是通過檢測血細胞中癌基因和抑癌基因的異常表達，該方法敏感性雖高，但假陽性率也較高，適用范圍有限。RT-PCR技術是在PCR技術的基礎上發展而來，擴增由血細胞中表達的腫瘤特異性mRNA序列逆轉錄的DNA片段，從而分析腫瘤特異性mRNA的表達水平。這些腫瘤特異性mRNA不表達于正常外周血細胞，且半衰期較短，在細胞裂解后會迅速被RNA酶降解，有較高的敏感性和特異性。在外周血中檢測到腫瘤特異性mRNA可以間接提示CTC的存在，腫瘤特異性mRNA水平可以間接反應CTC水平[17]。RT-PCR及其各種改進的技術可以對腫瘤特異性mRNA進行相對定量，甚至絕對定量，目前在CTC的檢測中應用最為廣泛，被認為是目前檢測CTC最有效的方法之一。

2 影響血液CTC水平的因素

2.1腫瘤疾病本身 CTC從實體瘤中脫落入血，其在血液中的數量與原發灶的性質、進展程度及機體的免疫狀態密切相關。CTC在血液中的水平與腫瘤的臨床分期、分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、淋巴結轉移、遠處轉移及復發均密切相關。Sastre等使用Cell Search系統檢測了94例結直腸癌患者的外周血CTC，發現CTC的陽性率為36.2%，且與結直腸癌的臨床分期相關(Ⅱ期20.7%，Ⅲ期24.1%，Ⅳ期60.7%)[18]。在無遠處轉移的結直腸癌患者中，其CTC數量隨著腫瘤的T分級、N分級、腫瘤大小、分化程度的惡性度升高而上升[19]。Akiyoshi等認為，CTC的數量也與腫瘤細胞的侵襲性顯著相關，經病理證實，中低分化的腫瘤細胞較高分化者，外周血更易檢出CTC[20]。此外，CTC存在于外周血中，要克服血流的剪切力、免疫系統、細胞因子及低氧等各種血液微環境的影響，其數量隨著由瘤灶脫落后的時間延長而減少[21]。反之，從外周血中檢測CTC的水平亦可反映腫瘤病灶的惡性程度、治療效果以及腫瘤的復發轉移。傳統評估腫瘤的惡性度，需先進行手術切除腫瘤病灶，且進行病理檢測，并根據病理結果進行臨床分期、選擇化療方案和評估預后，具有一定的盲目性。在臨床診療過程中，術前主要通過影像學檢測評估腫瘤是否發生遠處轉移，而部分患者發生遠處微轉移是影像學檢測不到的，這時通過檢測CTC進行評估可能是一個不錯的選擇。

2.2取樣部位 結直腸癌患者CTC的檢出率和表達水平與血樣采集血管的部位相關，腫瘤灶引流靜脈血和外周靜脈血往往存在一定差異。腫瘤病灶脫落入血的游離腫瘤細胞首先進入引流靜脈(腸系膜靜脈)，再經過門脈系統進入肝臟，最后匯入外周循環。因肝臟的過濾作用造成外周血中CTC水平比引流靜脈低。Rahbari等利用Cell Search系統檢測了200例結直腸癌患者腸系膜靜脈和外周靜脈中的CTC水平，發現Ⅱ及Ⅲ期結腸癌和中上段直腸癌的腸系膜靜脈血CTC的檢出率較外周靜脈更高[22]。門靜脈或腸系膜靜脈血中CTC水平較外周靜脈血高，預示著發生肝轉移風險性明顯增高[23]。腫瘤細胞由引流靜脈播散至遠處臟器，早期腫瘤患者外周靜脈血液中腫瘤細胞數量極少，臨床和科研中常從引流靜脈取血進行CTC檢測。

2.3手術操作 手術操作過程中，腫瘤組織受到擠壓、牽拉，易導致腫瘤細胞脫落入血，造成腫瘤播散的風險。Lelievre等通過動物實驗對比了腹腔鏡與開腹兩種術式對CTC的影響，發現術前及術后CTC的檢測率并未上升，且各手術組間并無差別，首次通過CTC對不同手術方式的腫瘤學效應進行了比較[24]。Park等通過對42例結腸癌患者的手術進程中的不同時間點，腸系膜下靜脈和外周血CEA mRNA和CK20 mRNA的水平進行檢測分析，發現其在術前外周靜脈血和腸系膜下靜脈血中的陽性率無顯著差別；調整腫瘤腸段后，其檢出率有升高趨勢，手術后較術前檢出率顯著升高，但不同手術方式間并無顯著性差異；認為無瘤操作技術是影響CTC入血數量的主要因素，而非手術方式[25]。Jussf等研究發現，術中采血是提高CTC捕獲效率的一個有效途徑[26]。手術使用的器械對腫瘤細胞入血也有一定影響，如超聲刀可使切開的組織及時凝固、血管閉合，降低癌細胞播散的機會[27]。“無瘤原則”是腫瘤根治術的基本原則，術中嚴格遵守無瘤原則，對減少腫瘤醫源性擴散及術后復發轉移、提高遠期療效有重要意義。

2.4檢測技術和方法 結直腸癌患者的CTC檢出率及表達水平與游離腫瘤細胞的富集和檢測技術密切相關。有效的檢測方法要求外周血富集后，能有效地區分外周血細胞和腫瘤細胞。至今為止，已開發超過40種檢測技術，且不斷有新的方法和技術出現，其敏感度和特異度各異[28-29]。Cell Search系統是基于免疫學原理最具代表性的CTC檢測技術，在上皮表型陰性的樣本中存在不同比例的CTC漏檢，例如EMT標志物在CK陰性和陽性的CTC中的陽性率分別為38%和28%，意味著如果僅用上皮性抗原作為CTC富集的標志，將會有三分之一以上的CTC被漏檢[30]。基于CTC的物理特性，不依賴細胞表面標志的檢測技術較好地克服了上述缺陷，如微流控芯片技術和微過濾技術[31]。Farace等用基于上皮腫瘤細胞體積的分離技術(ISET)檢測腫瘤患者外周血CTC，結果陽性率為95%[32]，而Cell Search系統的檢測陽性率僅為70%。Li等應用Cell search系統和ISET技術對61例食管鱗狀細胞癌患者進行檢測和對比，發現ISET方法檢出CTC 20例(32.8%)，而Cell Search系統檢出1例(1.6%)，兩者差別較大[33]。為了避免僅用單一方法檢測CTC出現的種種弊端，近年來應用多種方法聯合檢測也屢見不鮮。

3 CTC檢測的臨床應用

外周血CTC水平可以反映腫瘤患者循環中游離腫瘤細胞的負荷，其水平的變化可作為治療反應的一個敏感指標。惡性腫瘤疾病患者遠處器官微轉移與外周血中存在的CTC密切相關。CTC具有與腫瘤病灶高度相似的腫瘤特異性抗原或基因特征，從外周血中即可獲得，對CTC基因進行檢測可以間接反映腫瘤原發灶的生物學特征。CTC在腫瘤疾病的臨床診斷、治療指導及復發轉移監測中具有重要的臨床應用前景。

3.1CTC與腫瘤疾病診斷 CTC具有與原發腫瘤病灶高度相同的腫瘤特異性抗原和基因學特征，具有極高的腫瘤特異性。CTC“液態活檢”相對無創，對結直腸癌的診斷具有一定臨床價值。Wensy等報道，在620例門診患者中，腸鏡下診斷為腺瘤性息肉或早期至晚期結直腸癌438例，進一步行CTC檢測發現，111例(25%)為癌前病變，327例(75%)為結直腸癌，即CTC檢出癌前病變的靈敏度為76.6%、特異度為97.3%；檢出結直腸癌的靈敏度為86.9%、特異度為97.3%；檢出癌前病變和結直腸癌的準確率達88.0%[34]。提示CTC檢測有利于早期發現結直腸癌。另有研究表明，在非轉移性結直腸癌患者中，檢測到的CTC平均數量隨著腫瘤的T分期、N分期、腫瘤大小及分化程度的惡性度的升高而增加，而與患者的性別、年齡、CEA水平及大體類型無關[35]。CTC在早期腫瘤患者外周血中的數量極少，需經有效的方法富集和分離后才可檢出，在早期腫瘤的臨床診斷應用上具有一定局限性。

3.2CTC用于指導治療 結直腸癌術后輔助化療或者姑息化療的目的是清除殘留在循環中的游離腫瘤細胞以及微轉移灶，其基因學特性與手術切除的原發灶高度相似，但亦可能存在細微變異。直接檢測循環中CTC細胞的基因學特性或表觀遺傳學特征，可更直接指導輔助化療用藥。Musella等研究提示，通過CTC的基因檢測，可在接受治療前預測出抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)治療的療效，從而決定是否進行抗EGFR治療[36]。結直腸癌治療過程的一個重要挑戰就是如何選擇安全、可靠、及時的療效評估手段以驗證治療方法的有效性，或對效果不佳的治療方案進行調整，對CTC的監測在這方面具有重要的應用價值。Zhang等發現，CTC的持續陽性是接受化療的晚期結直腸癌患者無進展生存期和總體生存率的獨立危險因素[37]。對進展期和轉移性結直腸癌患者，化療和靶向治療的主要挑戰是腫瘤基因組的不穩定性和治療誘導性耐藥，故需開展連續動態活組織檢查，才能精準指導制訂治療決策[38]。在耐藥性方面，Abdallah等研究表明，通過CTC的胸苷酸合成酶的檢測，可預測出對5-氟尿嘧啶抵抗的患者[39]。轉移性結直腸癌患者檢測CTC更有意義，CTC的分子特征，尤其在細胞粘附、EMT方面比原發灶腫瘤細胞更能提示遠處轉移的跡象[40]。

3.3CTC用于復發轉移的監測 結直腸癌患者根治術后出現復發和轉移歸因于腫瘤細胞的傳播，此風險目前不能完全通過TNM分期系統進行評估。復發和遠處轉移是結直腸癌患者根治術后的主要死亡原因。Lu等證實，CTC持續陽性是Ⅱ～Ⅲ期結直腸癌患者復發及預后不良的危險信號[41]。Bork的研究也證實，CTC陽性是結直腸癌復發轉移的獨立預后危險因素[42]。然而，到底是術前還是術后的CTC數量提供更可靠的預后信息，目前并不明確。Aggarwal等發現，治療前CTC水平較低的患者(<3個，n=99)比較高的患者(≥3個，n=58)有更長的生存時間(20.8月vs11.7月)，且所有患者治療前血液中CEA均為陽性，可見CTC可提供更多預后信息[43]。當前，迫切需要尋找一個理想的能早期準確地評估胃腸腫瘤患者發生復發或轉移的指標，以使結直腸腫瘤的診療更加規范。

此外，CTC的體內或體外研究有助于開發新型抗癌藥物，研究藥物抵抗的作用機制，指導臨床用藥[44]。從分子學水平無創地對結直腸癌病情進行分析和診治，避免了傳統診治方法的弊端(需先手術切除病變組織進行病理檢測后再決定下一步診治方案)，能實現體外腫瘤基因分析，精準選擇治療方案，是人類未來腫瘤疾病治療的總體趨勢。

4 展 望

大量研究證實，CTC與腫瘤復發和轉移密切相關，檢測CTC有助于腫瘤轉移的早期診斷、臨床分期、療效監測及預后判斷，并為腫瘤患者的個體化治療提供有價值的臨床指導。CTC作為結直腸癌獨立的預后因素，可反映循環腫瘤負荷及腫瘤的生物學特性。有關結直腸癌CTC的研究還在不斷地深入，但問題依然存在[45]：(1)缺乏理想的CTC分子標志和陽性計數標準；(2)如何分析其異質性；(3)CTC在循環中存活及其基因型和表觀遺傳特性發揮作用的機制；(4)CTC體外培養技術難度高，傳代后基因型和表觀遺傳學。隨著高通量測序以及單細胞基因組擴增技術的優化，CTC的未來朝著單細胞組學發展，擺脫了腫瘤組織標本的限制，使非創傷性診斷、監測成為了可能，為結直腸癌的診斷、治療監測、預后評估等提供了簡便途徑。這也將有助于臨床醫師更深入地了解腫瘤轉移的生物學特性，動態實時地分析患者的腫瘤分子特征，為真正的個體化治療提供有價值的依據。