本溪地區鴨致病性大腸桿菌優勢血清性的交叉保護研究

高行空 苑興君

鴨致病性大腸桿菌（EPEC）感染是鴨個體被致病性大腸桿菌部分或全身感染的疾病?，F有本溪地區的禽病源性大腸桿菌（Avian Pathogenic Escherichia Coli， APEC）的研究數據多數來源于雞，缺乏鴨源EPEC病原特性的系統研究。鴨大腸桿菌病的病理特征多樣、臨床癥狀復雜、致病菌耐藥性差異大且不同血清型之間可能存在交叉保護。在鴨規模化飼養過程中，由大腸桿菌感染致死造成的損失較為常見，一直是困擾禽類養殖業的發展。近年來，隨著鴨規?；B殖逐步形成，禽流感、新城疫等主要疾病得到有效控制，大腸桿菌病因其重視程度差、防止效價低導致和致病性大腸桿菌在抗生素濫用下耐藥性不斷增強，患病率呈明顯上升趨勢。遼寧省本溪地區養鴨業發展迅速，研究本溪地區鴨源大腸桿菌O15、O35優勢血清型之間的交叉保護關系，確定單血清疫苗免疫保護是否有應用價值，以及交叉免疫導致大腸桿菌病變的能力強弱，對鴨大腸桿菌病的科學免疫有重要意義。

1試驗動物

實驗選用采購于沈陽茂華生物科技有限公司的1周齡雛鴨，飼養1周取健康、敲擊實驗籠反應正常的雛鴨45只。

2免疫菌液的制備

一級菌種制備：將篩選出O15和O35二種型菌株，在操作臺上用接種環涂布于麥康凱瓊脂基上，在37℃恒溫環境中連續培養24h，篩選典型菌落于標準瓊脂繼續培養24h，無菌、低溫環境備用。

二級菌種制備：將一級菌轉移到普通肉湯，37℃連續震蕩24h。吸取培養后菌液與普通瓊脂以1：1比例混合后在37℃再克氏瓶中培養24小時。用0.9%NaCl溶液沖洗克氏瓶，經無菌紗布過濾后無菌、低溫環境備用。

活菌計數：無菌條件下，移取二級菌種液lmL，按1：10逐步稀釋，按常規平板計數法使二級菌種液活菌含不低于1×1010 個/mL。

滅活：將二級菌懸液中加入0.4 %甲醛溶液，在37℃環境中靜置3d，每6～8h攪拌混勻。

內毒素檢測：移取0.1mL鱟試劑置于10×75mm玻璃試管中，便震蕩邊滴加0.1mL滅活菌液，在37℃水浴中放置1h，觀察結果。

3氫氧化鋁佐的制備

在60℃溫度下，移取8%氧化鋁溶液44mL，與42mL 4%的氫氧化鈉溶液攪拌混合，至出現鋁膠凝聚。調整pH至5.6～6.0，高溫滅菌2h后與二級菌液1：1混合，無菌、低溫環境備用。

4免疫菌液的檢驗

物理檢驗：肉眼觀菌液顏色，混懸狀態等。

無菌檢驗：將制備好的二級菌液分別經過T.G、GA、GP，檢查是否有菌落出現。

安全性檢驗：選取10只1周齡雛鴨，經腹部皮下注射0.2mL滅活菌液，記錄10d內雛鴨健康狀態，如果無不良反應則合格。

5方法

5.1大腸桿菌的交叉保護研究

隨機選取2周日齡雛鴨35只，分7組每組5只，每只經腹部皮下注射免疫菌液0.2mL。每組雛鴨分籠飼養，所用雛鴨接觸實驗器材分組使用，觀察1周后進行二次免疫，方法與初次免疫相同，觀察1周。二次免疫后，對雛鴨感染攻毒株菌液0.2mL/只。記錄發病時間、死亡時間。繼續飼養1周，頸椎脫臼法殺死所有雛鴨，無菌采集心臟和肝臟，分組情況為：

A組：初次和二次免疫苗為O15免疫株，用O15毒株感染，觀察雛鴨健康狀態。

B組：初次和二次免疫苗為O35免疫株，用O15毒株感染，觀察雛鴨健康狀態。

C組：初次和二次免疫為安慰劑，用O15毒株感染，觀察雛鴨健康狀態。

D組：初次和二次免疫苗為O15免疫株，用O35毒株感染，觀察雛鴨健康狀態。

E組：初次和二次免疫苗為O35免疫株，用O35毒株感染，觀察雛鴨健康狀態。

F組：初次和二次免疫為安慰劑，用O35毒株感染，觀察雛鴨健康狀態。

G組：空白組，初次和二次免疫為安慰劑，用安慰劑感染，觀察雛鴨健康狀態。

5.2試驗結果

未經免疫的雛鴨在感染O15和O35毒株后全部死亡;接受O15免疫后的雛鴨在感染O15毒株后個體健康無病變，在感染O35后全部死亡;接受O35免疫后的雛鴨在感染O35毒株后個體健康無病變，在感染O15后全部死亡;空白對照組雛鴨無死亡，剖檢觀察相應器官無病變。

5.3討論

試驗表明，單一免疫苗只對相應的毒攻株有免疫作用，但是對于不同的血清型的菌株無免疫作用，進一步證實了O15和O35之間無在交叉保護影響。因此，由于大腸桿菌在養殖場中多種血清型混合生長，單一菌的免疫不能滿足養殖場廣泛免疫的要求。建議本溪地區鴨養殖場在大腸桿菌免疫時，使用O15和O35的多價疫苗。經過雛鴨解剖，我們還發現雖然免疫苗對于不同的血清型的菌株無免疫作用，但接受過免疫個體被毒攻后的病征明顯弱于未經免疫的雛鴨。

本試驗還考慮到細菌內毒素的干擾。細菌內毒素是大腸桿菌細胞壁上特殊結構脂類，在受到特異性激活時分泌特殊遞質，控制中性粒細胞釋放熱源。在交叉保護試驗中內毒素可能引起內毒素休克，出現內循環紊亂，體內酸中毒。本試驗前的鱟試驗和安全性驗證已經保證滅活的菌液中內毒素全部去除。

所分離的鴨致病性大腸桿菌O15，O35優勢血淸型在雛鴨上不存在交叉保護。

（作者單位：117000遼寧省本溪市農業綜合發展服務中心）