淺談DGGE技術在食品微生物研究中的應用

魏曉恒

摘 要：DGGE（變性梯度凝膠電泳）是在含有從低到高的線性變性梯度的聚丙烯酰胺凝膠中的特異性雙鏈DNA片段的電泳。通過電泳， DNA片段移動到高濃度的變性劑中。當雙鏈的DNA在最低變性的標準下，完成最低濃度的變性劑時，形成部分斷鏈狀態，從而減慢其遷移速率。當產生這種變性時，就會發生序列特異性。所以，DGGE在理想的狀態下，就可以分解成均勻的DNA片段。這種分子標記的方式，有非常顯著的效果。它已廣泛應用于生物多樣性調查、遺傳關系鑒定、基因突變檢測等專業，在這篇文章中，對DGGE技術的概念，以及研究食品微生物的作用，都進行了總結，為我國食品安全的發展提供理論依據。

關鍵詞：DGGE技術;雙鏈DNA;基因檢測

中圖分類號：TS207.4 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）04-0215-02

0 引言

我們日常生活中的每一種食物，都會包含著不同的微生物。而我們日常生活中，對食物最普遍的污染就是食品微生物污染。目前的科學界中，食品微生物污染專業，以及食品衛生專業，他們主要研究的領域就是，對食物中微生物生活的環境以及其群體結構，有害微生物的測試。在針對微生物種群結構研究方面，變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electro—phoresis，DGGE）技術，是現在科學界中最關鍵的一種生物學方式。這個技術是在1979年，由Fischer和Lerman提出的，它是一種專門針對于DNA突變電泳，來進行測試的方法。這個方法的的使用，將傳統瓊脂糖凝膠電泳，以及聚丙烯酰胺凝膠電泳的測試，其準確程度提高到了一個核苷酸殘基的地步。在研究微生物的種群結構時，1993年Muyzer等人，將DGGE電泳測試方法運用到了里面。他們認為在對自然界中，微生物種群的繁殖和差異性進行研究時，使用這種方面在各方面都對其有利。DGGE技術在研究微生物分析生態學方面，已經得到了普遍的應用，其主要特點在于，能夠精準、迅速的對自然或者人工環境中，微生物的群落進行判斷，還可以微生物種群的繁衍、物種的興衰、基因等方面，進行分析研究。在這篇文章中，對DGGE技術的概念，以及研究食品微生物的作用，都進行了總結。

1 DGGE技術基本原理及操作流程

1.1 基本原理

采用聚合酶鏈反應（PCR）擴增DNA片段，分子量的變化、穩定、中等，以及其16S 核糖體RNA，或者是18S 核糖體RNA。擴增之后的DNA片段，其大小是一樣的，但是排布的規律是有區別的。在進行解離和變性凝膠時，不一樣的DNA片段，因為其特征的差異而被分解。由于G、C、A、T4堿基在DNA片段中，其排布的規律存在差異，所以雙鏈DNA分析其溫度上（tm），也存在一定的差異。低濃度變性劑下鏈接低TM DNA分子，在濃度高的變性劑下，就會鏈接高TM DNA分子，假設每組堿基都存在差異，那么濃度存在差異的變性劑，就要提供給堿基對一樣的雙鏈DNA分子。當變性劑的濃度適宜時，雙鏈DNA分子的鏈就會分解，而鏈停頓的越久，其在移動的過程中受到的阻礙就越多，DNA分子的電泳遷移率越低。當遷移電阻與電場力處于均衡的狀態，在濃度梯度發生變化的凝膠中，DNA分子就可以存活，所以，存在差異的DNA分子，就是變成獨立的條帶。

1.2 操作流程

實施DGGE這項技術完整的順序如下：（1）采集不同的食物;（2）從樣品中提取和純化總DNA或RNA;（3）可變區PCR或RT-PCR擴增;（4）預實驗（DGGE條件優化）;（5）DGGE凝膠的制備;（6）S的DGGE分析;樣本;（7）光譜分析;（8）對條帶的分布規律進行研究。這里面在研究的食物中，必須要先將總DNA進行提純，其中最重要的環節就是對產品進行設計，以及對PCR進行擴增。以上就是對DGGE技術的實行。

1.3 特點

實行DGGE技術的原理，首先16S核糖體RNA的引物，對增大一些細菌必須有顯著的效果，然后從實驗的食物中，提取出微生物基因組DNA，來進行特異性PCR擴增，然后將增大之后的微生物，使用DGGE技術來解離判斷，以此來對微生物進行研究。DGGE法是研究細菌群落結構最常用的分子生物學方法之一，它不需要培養，檢測限低，測試的效果明顯，成本低，結果精確，使用的范圍非常的廣泛。凝膠條帶0/1矩陣、峰矩陣、亮度矩陣分析凝膠圖樣，共同構成了DGGE凝膠分析法。在使用DGGE凝膠分析時，不同的條帶對實驗的精確會產生干擾，特別是在分析微生物的種群時，這種干擾更加明顯。

任何分析生物學的方法都不可能是完美的，都有需要完善的地方，DGGE技術也不例外，在分析DNA片段時，DGGE技術只能完成一部分，針對微生物的群落中，不到1%優勢的種群，其在分析過程中還存在一定的誤差。DGGE技術在進行解離時，對大片段沒有任何作用，這對系統的分析、獲取排布規律的信息，都產生了一定的阻礙。針對實驗對象的選取各方面而言，要求極其嚴苛，如果稍有疏忽，分布規律存在差異的DNA片段，就會一起進行移動。種類各異的DNA片段，分布的地方是一條DGGE帶，對研究對象的分析，存在一定的誤差。

2 DGGE技術在食品微生物研究中的應用

2.1 食品微生物的多樣性分析

現在的科學界中，研究食品微生物的方法有很多中，其中最為關鍵的就是DGGE技術，它對測試研究對象的微生活種群是至關重要的，在所有的微生物研究中，得到了普遍的使用。聚類分析（UPGMA）表明不同來源的樣品中微生物組分的相似性和相關性。樣品電泳圖譜中的條帶數目可以反映不同樣品間群落的相似性。通過計算群落相似系數，就能夠發現生物種群之間的不同之處。在對微生物的種群結構進行研究時，PCR-DGGE技術得出的結果是非常精確的，也給食物的安全提供了保障。在水產品、酒類、發酵食品、肉制品等行業，得到了普遍的使用。

鄭炯、夏雪娟、葉秀娟等人利用聚合酶鏈反應-聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術研究了竹筍的鹽度為5g/100mL和19g/mL的微生物菌群。結果表明，從鹽濃度較低（5g/100ml）的鹽芽中，經DNA提取、套式PCR、DGGE電泳和克隆測序，分離出4條明顯的亮帶。這些條帶被鑒定為西巴里亞魏氏菌、乳球菌屬、魏氏菌屬、乳酸乳球菌和鹽濃度高的鹽芽（19g/100ml）。從竹筍中分離出5條明顯的亮帶，分別為綠氣球菌、賴氨酸桿菌、未培養細菌、厭氧桿菌和芽孢桿菌，低鹽腌漬的優勢菌為益生菌，高鹽腌漬的優勢菌為益生菌。具有很強抵抗力的細菌。基于16S DNA的PCR-DGGE技術為分析竹筍的微生物多樣性提供了一種可靠、快速、有效的方法。

2.2 食品微生物動態監測

在同一個時間段內，研究對不同的實驗對象，可以使用DGGE技術，它對食品生產、儲存、發酵的過程中，各種微生物種群的變化，都進行了嚴格的檢測。對食品中微生物種群的變化，能夠在第一時間內，精準的檢測出來，對食品在工業化生產、貯藏環境的設置等方面，提供了很大的便利，也保障了食品的安全質量。所以，在對微生物種群的研究中，DGGE技術起著至關重要的作用。

冉甘橋、張紅巖、任平認為，經自然積累發酵預處理后，葛根總異黃酮的提取率提高了5.7%。然后，采用傳統平板法和PCR-DGGE技術對發酵過程中不同階段微生物區系的變化進行了分析，篩選出在發酵過程中起主要作用的微生物。結果表明，自然發酵過程中細菌數量呈上升-下降-再上升的趨勢，溫升期明顯增加，高溫期減少，冷卻期再次增加，整個發酵過程中真菌數量繼續增加。

任方方，趙笑，趙凱介紹了，變性梯度凝膠電泳技術的概念，以及研究動物微生物種群的作用，都進行了總結，并且，對此技術的應用前景進行了展望。

2.3 食品微生物快速鑒定

DGGE技術在提取微生物總核酸時，是從實驗對象中進行的，而不是使用以前的培養方式。經聚合酶鏈反應（PCR）擴增后，用DGGE獲得條帶，并進一步采用種或群特異性。在相同條件下，通過性探針與所獲得的條帶的雜交、條帶切割和再現后的測序，或者是與對照微生物，其DGGE電泳的數據，來直接進行對比，可以在短時間內，判斷出實驗對象中新生的微生物。

DGGE技術不依賴傳統的培養方法，直接從食品樣品中提取微生物總核酸。經聚合酶鏈反應（PCR）擴增后，用DGGE獲得條帶，并進一步采用種或群特異性。在相同條件下，通過性探針與所獲得的條帶的雜交、條帶切割和再現后的測序，或者是與對照微生物，其DGGE電泳的數據，來直接進行對比，可以在短時間內，判斷出實驗對象中新生的微生物。

3 結語

在研究食品微生物的領域，DGGE技術的發展前景非常好。使用這個技術，可以在最短的時間內，對食品成熟時微生物群落的演替進行測試，而且能有效地評價食品原料、中間產品和最終產品的質量，對食物在生產時，能夠進行嚴格的把關。并且，這個技術發展潛力也是無限的，比如：在食品的出處、食品是否有微生物污染、其生長的地理環境等。保障了食品的安全質量。

參考文獻

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