線粒體動力學與腫瘤的研究進展

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(1復旦大學附屬華山醫院普外科 上海 200040; 2復旦大學生物醫學研究院 上海 200032;3復旦大學腫瘤轉移研究所 上海 200040)

線粒體是由線粒體內膜(inner mitochondrial membrane,IMM)、線粒體間隙、線粒體外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)和線粒體基質組成的雙層膜結構的動態細胞器。線粒體是為細胞供能的重要細胞器,其中IMM向內皺褶形成嵴,是電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)裝配和氧化磷酸化的位點,氧化磷酸化是線粒體為細胞供能的主要方式,因此線粒體被稱為細胞的供能屋(powerhouse)。除供能外,線粒體還參與諸如細胞分化、細胞信息傳遞、細胞凋亡和調節Ca2+穩態等過程,并擁有調控細胞生長和細胞周期的能力。線粒體作為細胞的應激感受器,能夠根據環境的變化作出相應功能和結構的改變,如能量缺乏狀態、缺氧、氧化應激等。線粒體復雜的生物學功能與線粒體動力學的改變密切相關。

線粒體動力學Benda在1898年觀察到線粒體形態上的異質性,即線粒體可呈球形或線性。Lewis等[1]在1914年進一步發現,任何一種形態類型的線粒體(如顆粒、棒或線性),都可能會變成其他任何一種形態類型的線粒體,或者可能與另一種線粒體融合,或者可能會分裂成一個或多個線粒體,根據這一發現提出了線粒體動力學的基本概念。在不同的生命過程或外界刺激的作用下,線粒體持續的分裂和融合,保持一個動態的平衡,調節線粒體的形態、功能和數量[2]。

線粒體處在動態變化的過程中,不斷發生融合與分裂的相對平衡,導致了相互連接的、中間形態的或片段形態的線粒體混合狀態。在一定生理或病理改變狀態下,可發生該平衡的改變,線粒體融合或裂解狀態的增強,導致線粒體形態、功能和數量上的改變[2]。線粒體裂解與融合均由高度保守的三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)酶介導[3],裂解主要由動力相關蛋白1 (dynamin related protein,Drp1)、線粒體分裂蛋白1 (mitochondrial fission 1,Fis1)和線粒體分裂因子(mitochondrial fission factor,MFF)介導,而融合過程分為OMM的融合與IMM的融合,分別由線粒體融合蛋白(mitofusin,MFN)和視神經萎縮蛋白1(optic atrophy,OPA1)介導。

線粒體的裂解過程 線粒體裂解產生更小、更離散的線粒體,在一定的條件下能夠產生活性氧(reactive oxygen species,ROS),促進線粒體自噬或者加速細胞的增殖。Drp1是胞質蛋白[4],作為裂解的主要蛋白,激活后定位到線粒體膜上,形成環狀結構,收縮并分裂線粒體[5]。Drp1通過Fis1、MFF和線粒體延伸因子等非GTP酶受體蛋白主動靶向到線粒體膜上,與線粒體接觸的內質網協助裂變,裂變的過程可以形成Drp1、MFF和促凋亡蛋白的微區域[6]。

Drp1的活性由兩個關鍵絲氨酸磷酸化的相反作用迅速調節。絲氨酸616位點的磷酸化增強Drp1活性,而絲氨酸637位點的磷酸化則減弱其活性,絲氨酸616位點與637位點的磷酸化比例決定了Drp1活性[7-8]。Drp1活性也由泛素連接酶膜相關蛋白5[9]和小泛素樣修飾劑1[10]進行翻譯后調控。線粒體分裂抑制劑1(Mdivi-1)可以抑制Drp1的GTP酶活性,可抑制線粒體裂解過程[11]。

線粒體融合過程 線粒體的融合能夠導致相互連接的線粒體網絡,并增強與內質網的聯系;融合的過程還可以將線粒體中基質相融合,稀釋線粒體DNA累積的突變和其他線粒體有害分子。融合過程分為兩個步驟:OMM的融合與IMM的融合。

OMM的融合 OMM的融合需要MFN[12],包括MFN1和MFN2,兩者可形成同型或異型復合物介導OMM的融合。MFN1和MFN2具有高度同源性,但二者介導的水解活性和融合效率卻不相同,MFN1具有更強的水解活性和融合效率;而MFN2在線粒體與內質網融合網絡的形成上有更強的功能,在調節Ca2+穩態等功能上起到重要的作用[6,13-14]。

MFN受到各種翻譯后修飾以及與其他蛋白質直接相關的調節。結合這些調節機制決定哪些線粒體接觸將導致線粒體融合[15-16]。 MFN1和MFN2活性可以通過特異性磷酸化進行修飾,兩種蛋白質的泛素化可能導致其降解[17]。Parkin可以直接泛素化MFN2,導致其降解,并防止損傷的線粒體融合到健康的線粒體[18]。 MFN2也可以通過乙酰化進行調節,其脫乙酰化導致增強其對營養缺乏狀態的反應[19]。已經證明在健康細胞中,促凋亡Bcl-2家族成員Bax與MFN2相互作用并刺激線粒體融合[20]。

IMM的融合 OPA1是在OMM融合后依次介導IMM融合的GTP酶[12]。 OPA1有許多剪接變體,可以通過特異性蛋白水解切割進一步處理。 雖然IMM融合的確切機制尚不清楚,但OPA1已被證明是IMM融合所必需的[21]。 OMA1肽酶或i-AAA蛋白酶YME1L處理OPA1后,不僅抑制IMM融合活性,而且還可以直接促進線粒體碎裂[22]。 OPA1也被證明可以介導代謝重組,這是維持適當氧化磷酸化和細胞凋亡的關鍵,獨立于IMM融合的功能[23]。

線粒體動力學與腫瘤線粒體與疾病有密切的聯系。首先,線粒體擁有自身的遺傳物質和遺傳體系,線粒體基因組的異常會導致一大類遺傳代謝疾病,稱為線粒體病,如母系遺傳Leigh綜合征、線粒體肌、Leer遺傳性視神經病等[24]。除遺傳類疾病外,線粒體還與其他諸多臨床疾病相關,如腫瘤、心血管疾病、神經退行性病變及肺動脈高壓等[7,25-26],這些疾病的發生多伴有線粒體功能和/或結構的紊亂。研究發現細胞環境的變化,尤其是病理狀態下細胞環境的改變,可以觸發線粒體融合或裂解相關蛋白功能或活性的改變,而融合與裂解相關蛋白的改變直接影響線粒體融合和裂解的過程,即線粒體動力學的變化。線粒體動力學被認為是一個認識復雜疾病的新角度,其與疾病之間的機制有待于進一步的探究。

在不同腫瘤患者中均發現了線粒體動力學的不平衡,具有裂解過程的增強和/或融合過程的減弱,導致線粒體形態上的碎片化。在肝癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中均發現了裂解相關蛋白表達升高,而融合相關蛋白表達降低,提示在腫瘤中線粒體動力學狀態的改變[27-32]。

線粒體動力學與腫瘤的增殖 線粒體動力學在癌癥中的作用涉及有絲分裂期線粒體分裂的要求。線粒體分裂與有絲分裂(裂變)之間的這種協調確保了線粒體向子細胞的平等分配[7]。在從G1期到S期的過渡期,線粒體融合并增加ATP的產生[33]。細胞周期的進展和線粒體形態的協調是緊密相連的,線粒體裂變對線粒體適當分離到子細胞至關重要。在正常細胞中,長時間的線粒體融合對細胞分裂有害,會導致有絲分裂染色體排列缺陷,從而抑制細胞的有絲分裂[34]。研究發現,Drp1的減少可減緩小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)的生長,并降低Ki67(細胞增殖標記物)水平。而細胞周期蛋白依賴性激酶Cdk1通過S616位點的磷酸化激活Drp1,在G1-S轉化點通過降低Drp1的活性可增加線粒體的融合狀態[34]。Drp1的抑制可誘導線粒體的融合(通過抑制裂解過程)可增加細胞周期蛋白E的表達并引發DNA復制,引發G2/M檢查點的激活,導致細胞周期停滯[35]。總之,細胞周期內異常線粒體的融合可通過影響細胞周期抑制細胞的增殖。從癌細胞角度來看,線粒體裂解的抑制或線粒體融合的促進可能減慢細胞的增殖。在肺癌細胞中,抑制Drp1或過表達MFN2可抑制肺癌細胞進入細胞周期的能力,并在裸鼠模型中降低腫瘤的生長[32]。在肺癌細胞系與肺癌患者標本中發現Drp1與MFN2蛋白比例的升高,同樣提示在肺癌中線粒體裂解狀態的增強;在體內及體外實驗中過表達MFN2、敲低Drp1或使用Drp1抑制劑都可抑制肺癌細胞的增殖并增加其凋亡[36]。

線粒體動力學與腫瘤的凋亡 線粒體在細胞凋亡中起到決定性的作用,因此,其動力學狀態的改變必然會影響細胞的凋亡狀態。細胞的凋亡總是對應線粒體裂解狀態的改變,研究發現,Bax和Bak在凋亡的初始階段與Drp1共定位[20,37]。在HeLa細胞(宮頸癌細胞系)中敲低Drp1,可以延遲細胞色素C的釋放,表明Drp1在細胞凋亡中發揮重要的作用[38]。凋亡與線粒體動力學狀態可能是相互作用的,有證據提示凋亡的機制可以影響線粒體動力學,例如Bax和Bak可能參與線粒體的融合,可溶性的Bax可以通過與MFN2的相互作用促進線粒體融合[39]。研究認為線粒體的融合可抑制細胞的凋亡,而線粒體裂解與細胞凋亡相關。凋亡抑制是腫瘤的特點之一。在腫瘤組織中線粒體裂解相關蛋白表達較癌旁組織更高,而MFN則相反[16]。以肝癌為例,肝癌中Drp1與MFN1比例上升,提示在肝癌中線粒體裂解增強而融合減弱,而且Drp1和MFN1比例上升的肝癌患者預后更差。通過過表達Drp1蛋白或敲低MFN1蛋白表達發現,線粒體裂解狀態的增強和融合狀態的抑制可促進肝癌細胞自噬并抑制線粒體依賴的細胞凋亡,從而促進肝癌細胞的增殖[28]。另有研究認為,MFN2在肝癌與癌旁組織中表達有更大差異并發揮更重要的作用,MFN2表達與腫瘤大小及TNM分期有關,MFN2低表達提示患者不良預后。在HepG2細胞中過表達MFN2可降低線粒體膜電位和內質網Ca2+濃度并升高細胞內ROS和線粒體內Ca2+濃度,從而介導肝癌細胞的凋亡[27]。然而,有研究認為Drp1介導的線粒體裂解并不足以進行細胞凋亡[40],線粒體動力學狀態與凋亡的關系還有待進一步的研究。

線粒體動力學與腫瘤的遷徙與轉移 線粒體在哺乳動物細胞中與肌動蛋白和微管細胞骨架接觸并由功能調節。 Ji等[41]認為,肌動蛋白促進Drp1募集到線粒體中以促進線粒體裂變,并且還顯示在Drp1被募集到線粒體之前,肌動蛋白絲可以在Drp1作用于線粒體膜的位置聚集以增加線粒體裂解的概率和機會。提示線粒體動力學狀態與細胞的遷移能力有關。 Korobova等[42]認為,定位于內質網與線粒體收縮部位的肌動蛋白絲是線粒體裂變所必需的。肌動蛋白動力學和Drp1之間的這些聯系均提示Drp1和線粒體裂變在細胞運動與遷移中發揮作用,并具有依賴于肌動蛋白動力學的高能量需求的生物過程。在乳腺癌表型中發現,與非轉移性的乳腺癌相比,在侵襲性乳腺癌或有淋巴結轉移的乳腺癌中,與裂解狀態相關的Drp1蛋白表達更高,而與融合狀態相關的MFN1蛋白表達更低。

在乳腺癌腫瘤細胞中促進線粒體的融合狀態,其侵襲轉移能力下降;相反,增強其線粒體的裂解狀態,發現其侵襲轉移能力增強,并發現腫瘤細胞偽足(lamellipodia)的形成,提示線粒體動力學狀態的改變可能會影響細胞骨架的重塑。免疫熒光發現碎片樣的線粒體向偽足樣結構處聚集,可能原因是為偽足提供更多的能量以增強偽足的運動能力[31]。在膠質母細胞瘤和神經膠質瘤細胞系也發現了類似的現象[43-44]。敲低Drp1可以降低Ras同系物家族成員A(RhoA)和Rho相關的卷曲螺旋含蛋白激酶1(Rho associated coiled coil containing protein kinase 1,ROCK1),RhoA與ROCK1為肌動蛋白細胞骨架動力學和細胞運動的關鍵調節劑,其水平的改變表示其細胞骨架的重塑及細胞運動能力的改變[44]。在高血糖條件下,小鼠足細胞和內皮細胞中發現ROCK1磷酸化并激活Drp1,觸發線粒體裂變[45]。雖然這項研究未探討細胞運動和遷移,但這一發現提示Drp1和Drp1介導的線粒體裂變可能促進ROCK1的前饋調控循環,以促進細胞運動和遷移。

線粒體動力學與腫瘤的代謝 線粒體作為重要的能量代謝的細胞器,其動力學狀態的改變影響細胞的代謝狀態。腫瘤細胞最經典的代謝改變為Warburg效應,即有氧條件下糖酵解優先于氧化磷酸化[46]。即使在高氧條件下,這種代謝的轉換使得腫瘤細胞維持其快速的增殖速度并在腫瘤微環境缺氧條件下更好的存活。線粒體融合的增加可以促進更有效的氧化磷酸化并有更多ATP的產生,而線粒體融合的喪失(即線粒體的裂解),可導致線粒體膜電位的破壞,從而導致線粒體氧化磷酸化的減少[5,47]。在MFN1和MFN2敲低的細胞中發現,線粒體的呼吸鏈受到破壞,氧化磷酸化減少[48]。而OPA1驅動的線粒體嵴重塑也在不同細胞中表現為調節ATP產生和氧化磷酸化的必要條件[49]。線粒體形態的調節不僅可以影響細胞的呼吸和能量調節,反之細胞能量狀態的改變也可以影響線粒體動力學,高脂飲食可以減少MFN2的轉錄并促進線粒體的裂解[50]。根據以上結果推測,線粒體動力學的變化與代謝狀態的改變可能存在某種相關聯的機制。在T細胞中發現,記憶性T細胞和效應性T細胞存在不同的線粒體動力學狀態及代謝狀態,通過改變線粒體動力學狀態可以改變T細胞的代謝狀態及功能,即改變線粒體動力學狀態可通過改變T細胞的代謝狀態而影響T細胞的表型,促進效應性T細胞的線粒體[51]。氧化磷酸化向有氧糖酵解的代謝改變經常伴隨線粒體網絡的裂解而出現[52]。例如,在神經母細胞瘤細胞和膀胱癌細胞中觀察到線粒體裂解和糖酵解之間的相關性[53-54]。

線粒體動力學與腫瘤的自噬 自噬作為癌細胞獲取能量及大分子的另一種方式,在腫瘤中發揮重要作用。自噬可以消除功能障礙的細胞成分(包括線粒體),以維持整體細胞的健康[55]。損傷線粒體去除不足時ROS含量增加,導致線粒體DNA(mtDNA)和核DNA中突變的積累,有利于癌癥發病。 線粒體自噬涉及去除含有高水平ROS的受損線粒體[56-57],ROS積累可以通過線粒體膜去極化和Parkin/PINK1通路激活自身促進線粒體融合[58],從而抑制初始腫瘤生長。研究發現,Parkin缺陷小鼠自發性發展為肝腫瘤[59],而且Parkin可以直接泛素化MFN2,導致其降解,并防止損傷的線粒體融合到健康的線粒體。在神經母細胞瘤中發現PINK1突變[60]。線粒體融合通過抑制Drp1蛋白或過表達OPA1蛋白介導的線粒體裂解過程的減弱,可抑制自噬[13]。在肝癌中同樣發現線粒體動力學狀態的改變可以影響自噬而改變腫瘤的進程,肝癌中線粒體裂解增強,融合減弱,可促進腫瘤細胞自噬,抑制凋亡,從而推動腫瘤的進展[28]。

線粒體動力學相關基因作為腫瘤治療的潛在靶點將線粒體動力學作為人類癌癥治療靶點的主要限制因素是,缺少可選擇性影響線粒體動力學蛋白的特定藥物。 Drp1抑制劑Mdivi-1是目前能夠影響線粒體動力學表征的最佳藥物[11]。鑒于Drp1介導的線粒體裂變在腫瘤細胞增殖和轉移中的作用,Mdivi-1具有潛在的抗腫瘤作用。在肺癌中,Mdivi-1可誘導腫瘤細胞增殖停滯[32]。Mdivi-1治療后可導致超融合線粒體網絡及有絲分裂紡錘體組裝受損并誘導非整倍體,最終導致腫瘤細胞凋亡[61]。在腦腫瘤起始細胞中Drp1水平上調,Mdivi-1治療誘導凋亡,從而降低腫瘤形成能力[62]。但Mdivi-1的作用可能不局限于對Drp1的抑制,在神經元和MEF細胞系中,Mdivi-1影響ROS水平和ETC復合物Ⅰ,但Mdivi-1的應用并不影響線粒體長度或Drp1水平[63]。鑒于線粒體形態的長期改變具有較大的危害,Mdivi-1治療可以局部應用或明確線粒體裂變的時間窗后應用,并有望成為抗癌藥物,但其細胞毒性仍需進一步解決。

最近發現的另一種稱為p110的Drp1抑制劑能夠阻斷Drp1-Fis1相互作用,從而阻止Drp1募集到線粒體,線粒體碎裂和ROS產生,從而影響凋亡和細胞活力。 這已經在神經退行性疾病的神經元細胞模型中被觀察到[64]。 這種新型抑制劑對于治療癌癥的潛在作用尚不清楚。

已知的針對線粒體融合的藥物有M1和S3。M1能夠介導線粒體融合,導致線粒體的延長,在SH-SY5Y細胞(神經母細胞瘤細胞)中使用可導致腫瘤細胞凋亡,但其具體機制并不清楚[65]。S3通過抑制去泛素化酶USP30影響MFN1/2泛素化修飾水平,增強MFN1/2的功能從而促進線粒體的融合[66]。與p110相同,M1和S3在腫瘤中的應用仍有待進一步探索。

結語線粒體動力學及其相關蛋白在腫瘤的發生、發展及轉移過程中均起到重要的作用,而線粒體動力學中裂解狀態和融合狀態的平衡傾向與腫瘤的代謝、凋亡、自噬等改變可能存在一定的調控機制,有待進一步探索。線粒體動力學相關蛋白的異常可作為腫瘤個性化治療的預測指標,可能成為一種新的腫瘤治療靶點,針對特定線粒體動力學狀態的患者給予相應的治療。