江華苦茶新品系紅茶發(fā)酵性研究

劉 振，楊培迪，成 楊，趙 洋，張曙光，寧 靜，楊 陽

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，國家茶樹改良中心 湖南分中心，農(nóng)業(yè)部湖南茶樹及茶葉觀測實驗站，湖南 長沙 410125）

苦茶是我國特有的一類茶樹（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）資源，多分布于粵、湘、贛毗鄰區(qū)，其中尤以南嶺山脈兩側(cè)最多。它們在植物學(xué)形態(tài)上多是小喬木型，葉大質(zhì)軟，葉面平整富光澤，芽葉茸毛少。具有萌發(fā)遲，芽葉味苦，有特殊香味等特征[1-3]。莊晚芳等[4]和陳興琰等[5]通過苦茶形態(tài)學(xué)、染色體對稱性和生化成分等多方面綜合分析認(rèn)為苦茶有可能是阿薩姆茶和茶雜交產(chǎn)生的雜交后代，是喬木型大葉種向灌木型茶變種過渡的中間類型。

湖南省地處茶樹種質(zhì)資源遺傳演化過渡帶，而江華苦茶則是這一過渡過程中代表性的資源類型[6-8]。江華苦茶主要分布在湖南省南部的江華地區(qū)，是湖南四大地方群體資源之一，1987年被認(rèn)定為湖南省優(yōu)良地方群體品種。該資源茶多酚含量高，抗寒性強，制作紅碎茶可達(dá)到二套樣水平，是提高湖南紅茶品質(zhì)特別是湖南紅碎茶品質(zhì)和進(jìn)行紅茶品種選育的寶貴資源[9-10]。從20世紀(jì)七十年代開始，劉寶祥等開始對江華苦茶進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并在苦茶品種中選育了一批茶樹新品系[1]。但是由于九十年代以后，我國紅茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的衰退，江華苦茶資源研究一度處于中斷狀態(tài)。近年來，隨著我國紅茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，紅茶新品種的選育已成為目前我國茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的熱點，因此進(jìn)行江華苦茶新品種的選育研究已顯得非常必要。本文在前人研究基礎(chǔ)上，對從江華苦茶中篩選的26個品系進(jìn)行了生化成分測定和發(fā)酵性研究，以期從中選育出優(yōu)質(zhì)紅茶新品系。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的26個江華苦茶新品系和對照櫧葉齊均位于長沙縣金井茶場。生化樣為一芽二葉，用蒸汽殺青固樣，酶活力測定的一芽二葉樣品用液氮迅速冷卻，-80℃冰箱保存待用。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；超聲波清洗機（上海臺姆超生設(shè)備有限公司）；恒溫磁力攪拌器（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；F50酶標(biāo)儀（奧地利Tecan）；RT-3000洗板機（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；5427 R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf）；HH-4水浴鍋（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所）；萬深LA-S全能型植物圖像分析儀（杭州萬深檢測科技有限公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 生化成分測定

茶多酚總量測定參照GB/T 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法；游離氨基酸總量測定參照GB/T 8314-2013茶游離氨基酸總量測定；水浸出物含量測定參照GB/T 8305-2013茶水浸出物測定；咖啡堿含量測定參照GB/T 8312-2013茶咖啡堿測定。

1.3.2 氯仿發(fā)酵性

采用干燥皿進(jìn)行氯仿發(fā)酵性處理。將200 mL氯仿倒入干燥皿底部，中間用帶孔格擋分開。分別將鑒定的葉片放入帶孔格擋上層，每個品種放置3個一芽二葉，用保鮮膜對干燥皿進(jìn)行封口，然后再蓋上蓋子。春季發(fā)酵時間為60 min，取出葉片，并采用植物圖像分析儀進(jìn)行紅色成分、藍(lán)色成分、綠色成分和葉綠素參考值等的測定。同時采用發(fā)酵指數(shù)進(jìn)行紅變程度的評價。發(fā)酵指數(shù)評價標(biāo)準(zhǔn)參照段繼華等[11]的方法，1.5分，葉色紅棕，均勻明亮，變色速度快；1.4分，葉色紅棕，變色速度稍慢；1.3分，葉色金黃；1.2分，葉色黃；1.1分，葉色暗黃，主脈綠色；1.0分，葉色黃綠或綠，變色速度慢或幾乎不變色。夏季直接進(jìn)行氯仿發(fā)酵的紅變程度評分。

1.3.3 酶活力測定

采用ELISA試劑盒法進(jìn)行酶活測定，植物多酚氧化酶（PPO） ELISA檢測試劑盒購于上海通蔚生物科技有限公司，操作步驟參考試劑盒說明書，每個樣品三次重復(fù)。

2 試驗結(jié)果

2.1 生化成分含量

表1研究結(jié)果表明：春季江華苦茶新品系的水浸出物含量高于對照櫧葉齊的有17個，平均值為41.31%；高于40.00%的有20個，最高的為46.97%（A20-2），最低的為36.54%（B17-2）。茶多酚高于對照的有17個，平均值27.86%；高于30.00%的有5個，最高為36.25%（A20-2），最低為21.49%（B13-1）。氨基酸含量高于對照的有15個，平均值3.50%，最高為4.89%（B13-1）。最低為2.73%（B1-2）。咖啡堿含量高于對照的有25個，平均值4.76%，高于5%的有8個，最高的為6.20%（A20-2），最低為3.74%（B17-2）。生化成分變異系數(shù)從大到小的順序依次為氨基酸（14.29%）、茶多酚（11.56%）、咖啡堿（10.08%）和水浸出物（5.74%）。

表1 26個江華苦茶新品系春季生化成分測定結(jié)果Table 1 Determination Results of biochemical composition of 26 new strains in spring

2.2 氯仿發(fā)酵性結(jié)果

春季發(fā)酵性測定結(jié)果（表2）表明：紅色成分最大的為A20-1（121.3±28.4）、最小的為B16-2（100.7±8.3）；藍(lán)色成分最大的為A9-1（75.9±12.5）、最小為 B1-2（60.0±2.0）；綠色成分最大的為B13-1（117.0±14.1）、最小的為A24-2（94.0±7.9）；葉綠素參考值最大的為B3-2（2.0±0.4）、最小的為 A38-1（0.3±0.3）。紅變程度評分所得的發(fā)酵指數(shù)與紅色成分值、與葉綠素參考值的大小不完全一致，春季發(fā)酵指數(shù)高于對照櫧葉齊的有18個，其中最高的為1.4（A24-1和A38-1），與對照相同的有8個。

表2 26個江華苦茶新品系春季發(fā)酵性Table 2 Fermentability of 26 new strains of Jianghua Kucha tea in spring

26個苦茶新品系的夏季發(fā)酵結(jié)果表明，發(fā)酵指數(shù)高于對照櫧葉齊的有17個品系，比對照低的有4個品系，與對照相當(dāng)?shù)挠?個品系。發(fā)酵指數(shù)達(dá)到1.3的有16個，分別為B1-2、B6-2、B13-1、B17-2、B19-1、B19-2、A28-1、A29-1、A8-1、A9-1、A21-1、A24-1、A24-2、A31-1、A36-1和A38-1，其中有5個的發(fā)酵指數(shù)為1.5，分別為B17-2、B19-1、A8-1、A24-2和A36-1，說明這5個品系的發(fā)酵性非常好。

2.3 PPO活性

對江華苦茶新品系進(jìn)行PPO酶活性測定，結(jié)果（圖1）表明，26個品系的PPO酶活性平均值為1907.1U/mL，最高為2176.1U/mL（B19-1），最低為1642.89 U/mL（B19-2），所有品系均高于對照櫧葉齊，江華苦茶資源具有較好的紅茶發(fā)酵性。PPO酶活性高于2000 U/mL的有7個品系，分別為 B1-2、B16-2、B17-2、B19-1、A29-1、A24-2和A38-1，低于1700 U/mL的有3個品系，分別為A3-1、B19-2和A32-1。

表3 26個江華苦茶新品系夏季發(fā)酵性Table 3 Fermentability of 26 new strains of Jianghua Kucha tea in summer

3 討論

3.1 江華苦茶新品系的生化成分

王新超等[3]對保存于國家種質(zhì)杭州茶樹資源圃的24份苦茶資源進(jìn)行了主要化學(xué)成分的測定與評價。結(jié)果表明，在體現(xiàn)茶類適制性的指標(biāo)上，苦茶資源具有適制紅茶的品種特點。劉寶祥等[1]對江華苦茶進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明：江華苦茶的多酚類化合物和水浸出物總量顯著高于櫧葉齊等栽培型群體品種，是一個適制紅茶的優(yōu)良品種。李丹等[12]對江華苦茶進(jìn)行了生化成分鑒定評價，從江華苦茶種質(zhì)資源中篩選出高茶多酚 （＞34.0%）資源14份、高咖啡堿（＞6.0%） 資源14份、高水浸出物（＞48.0%）資源19份，并且認(rèn)為江華苦茶群體在篩選高EGCG、高咖啡堿和高茶多酚等資源方面具有較強的潛力。楊春等[13]以江華苦茶群體品種資源為試驗材料，從中篩選出了春、夏、秋三季咖啡堿含量平均值高于5.00%的高咖啡堿單株4個。李賽君等[14]從江華苦茶中選育了茶樹新品種瀟湘紅21-1，且加工紅、綠茶中咖啡堿含量均達(dá)5%以上。本試驗研究與前人的研究結(jié)果相似，26個江華苦茶新品系的水浸出物平均值為41.31%，茶多酚平均值27.86%，咖啡堿平均值4.76%，具有水浸出物、茶多酚和咖啡堿含量高的品種特征，可以作為優(yōu)質(zhì)紅茶品種選育的目標(biāo)群體資源。

圖1 26個江華苦茶新品系的PPO活性Fig.1 PPO activity of 26 new strains of Jianghua Kucha tea

3.2 江華苦茶新品系的發(fā)酵性

發(fā)酵是紅茶加工過程中的一項重要工序，紅茶發(fā)酵是在酶促作用下以茶樹芽葉中多種兒茶素組分氧化為主體的一系列化學(xué)變化，底物和酶共同決定了鮮葉發(fā)酵能力的強弱[15-16]。沈丹玉等[17]結(jié)合茶樹鮮葉生化成分測定和發(fā)酵性能鑒定表明，兒茶素總量，特別是EGCG、EGC和ECG等酯型兒茶素及咖啡堿與發(fā)酵效果呈極顯著高度正相關(guān)。本研究中，26個江華苦茶新品系的茶多酚含量與其發(fā)酵性并非完全一致，比如兩次發(fā)酵性均較好的A13-1和B38-1，其茶多酚含量卻相對較低（分別為21.49%和25.76%），而茶多酚含量較高的B3-1（31.17%）和A20-2（36.25%）的發(fā)酵性評價卻相對較差。由此可見，紅茶發(fā)酵是一個復(fù)雜的過程，受溫度、生化成分和酶活等多種因素的影響，單獨依靠茶多酚類或某個單一指標(biāo)還不能完全反映品系間的發(fā)酵性強弱，進(jìn)行兒茶素總量、特別是酯型兒茶素與發(fā)酵性能的相關(guān)性研究是本研究后續(xù)需要完善的內(nèi)容之一。PPO酶活性測定表明，PPO酶活性的大小順序基本與發(fā)酵性評價結(jié)果相一致，在結(jié)果上更能反映不同品系的發(fā)酵性，比如PPO酶活性最高的7個品系中有6個都具有穩(wěn)定且較好的氯仿發(fā)酵性。

在紅茶發(fā)酵性的判斷上，本試驗研究采用葉片圖像分析儀進(jìn)行了紅色成分、藍(lán)色成分、綠色成分和葉綠素參考值等的測定，其結(jié)果與眼睛觀察的發(fā)酵性不完全吻合，這可能與葉片成色系統(tǒng)的復(fù)雜性有關(guān)。洪文娟[18]研究認(rèn)為，國內(nèi)工夫紅茶成條形，有別于國外紅碎茶，發(fā)酵葉的表面顏色分布不均，基于圖像處理檢測判斷的發(fā)酵性，與取樣代表性、精度低、評價模型差等都有很強的相關(guān)性。因此，通過基于圖像色澤來判斷發(fā)酵性還需要基于色澤和紋理等多特征參數(shù)來綜合判斷，建立多信息參數(shù)的發(fā)酵適度判別方法和預(yù)測模型，進(jìn)而更加準(zhǔn)確地反映不同品種的發(fā)酵性。

本試驗研究結(jié)合生化成分、氯仿發(fā)酵性和PPO酶活性的測定結(jié)果，初步選育出了發(fā)酵穩(wěn)定、酶活性較高，可能適制紅茶的苦茶新品系6個，分別為B1-2、B17-2、B19-1、A8-1、A24-2和A38-1，為后期優(yōu)質(zhì)紅茶品種選育提供了豐富的遺傳材料。