白茶提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥的影響

周 方，張楊波，鄭 新，林海燕,3*

(1.湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南長沙410128；3.湖南省植物功能成分利用協調創新中心，湖南 長沙 410128)

白茶是我國特種茶之一，發源于中國福建福鼎，具有抗輻射、抗氧化、抗腫瘤和降血壓、降血脂、降血糖等功效[1]。不同年份的白茶化學成分含量不同，其兒茶素組分含量總趨勢一致，表現為EGCG（表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯）>ECG（表兒茶素沒食子酸脂）>EGC（表沒食子酸兒茶素） >EC（表兒茶素） >C（兒茶素），即酯型兒茶素比例較高。白茶中含有咖啡堿、可溶性糖、氨基酸和黃酮類等物質，對茶葉的品質及藥理功效起到了重要的作用[2]。

炎癥是病原微生物侵入機體內造成機體內一系列不正常的病理性反應，而且在炎癥的整個過程都受到炎癥相關信號分子的嚴格調控，這些信號分子與炎癥的發生、維持和消退有著密切聯系。白茶中含有大量的茶多酚、茶氨酸等生物活性成分，研究發現這些活性單體成分在許多體外細胞實驗和體內動物實驗中具有較好的抗炎功效[3-5]。

本實驗選用LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7建立炎癥反應模型[6]，選用一氧化氮（NO）與白介素-6（IL-6）這兩個炎癥因子探討白茶提取物對RAW264.7的抗炎效果[7-8]；探究白茶提取物對一氧化氮合酶（iNOS）與IL-6等mRNA表達的影響及其在核酸水平上的作用效果。本研究通過建立炎癥模型，研究白茶提取物抗炎功效，為后續研究老年衰退性疾病與代謝綜合征提供參考。

1 材料與儀器

細胞RAW264.7小鼠巨噬細胞株系（自中國醫學科學院細胞中心）；新白茶（2018年白牡丹，福建品品香公司）、陳年白茶（2014年白牡丹，福建品品香公司）；噻唑藍（Amresco)；DMSO、LPS、吲哚美辛（Sigma）；胎牛血清(Hyclone)；PBS（索萊寶）；qPCR引物（上海生工）；DMEM培養基（上海生工）；胎牛血清（BI）；SYBR熒光染料（TakaRa）；NO試劑盒（碧云天）；總RNA提取試劑盒 （全式金）；RNA反轉錄試劑盒（全式金）。

旋轉蒸發濃縮儀(EL-131 Buchi)；高速冷凍干燥機（Christ）；超凈工作臺（力康opticlean-1300）；CO2培養箱 （Nuaire）；倒置顯微鏡 （Leica Microsystems）；熒光定量PCR儀（Thermo）；多功能酶標儀（Thermo）；普通離心機（Rotina）；精密電子天平（Starorius）等。

2 實驗方法

2.1 白茶提取物的制備

稱取不同年份白茶茶樣100 g，加入1000 mL沸水水浴加熱30 min，過濾后再加入沸水定容500 mL，水浴25 min，合并濾液經冷凍干燥48 h制成茶粉，-20℃保存備用。

2.2 白茶提取物主要成分測定

茶多酚的測定采用福林酚比色法，參照國家標準GB/T8313-2008；黃酮類化合物總量測定采用三氯化鋁比色法[9]；游離氨基酸的測定參照國家標準GB/T8314-2013；兒茶素組分、生物堿和沒食子酸含量的測定采用HPLC檢測法[10]。

2.3 RAW264.7細胞培養與分組

液氮凍存的RAW264.7小鼠巨噬細胞系復蘇后，放置于5%CO2、37℃培養箱中培養。細胞密度達70%～80%時，按照1∶4至1∶8比例傳代。當細胞處于對數生長期時即可進行實驗。

空白對照組（control）：不做任何處理，正常培養24 h；炎癥模型組：1 μg/mL LPS持續刺激細胞24 h；處理組：不同濃度白茶提取物（10 μg/mL、30 μg/mL 和 50 μg/mL） 處理細胞24 h；LPS（1μg/mL） 和不同濃度白茶提取物（10 μg/mL、30 μg/mL 和 50μg/mL） 共同處理細胞 24 h；不同濃度 EGCG（1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和20 μM） 單獨處理細胞24 h； LPS（1 μg/mL） 和 不 同 濃 度 EGCG（1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和 20 μM） 共同處理24 h；陽性藥物組：1 μg/mL LPS和 20 μg/mL吲哚美辛[11]共同處理細胞24h。

2.4 RW264.7細胞炎癥模型的建立

收集對數生長期的細胞，按1×104密度接種于96孔板，待細胞生長到對數生長期時用移液槍吸出每孔舊的培養液，分別加入含有不同濃度 （0 μg/mL、1μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL） LPS的培養基，培養24 h后取上清培養液，于3000 rpm、4℃離心10 min，取上清液用于NO試劑盒檢測炎性因子NO的分泌量；與上述操作一致的96孔板中加入MTT染色，培養箱內培養4 h后棄上清液，加入DMSO（150 μL/孔），搖床上輕晃10 min使細胞內晶體完全溶解后，酶標儀檢測吸光度值OD（波長為570 nm）以檢測LPS對細胞活力影響。具體計算公式如下：

2.5 MTT法檢測白茶提取物對RAW264.7細胞活力影響

收集對數生長期的細胞，按1×104密度接種于96孔板。24 h后，空白組不作任何處理；模型組按照LPS最佳濃度誘導；處理組用不同濃度白茶提取物（10μg/mL、30 μg/mL和 50 μg/mL） 單獨處理細胞以及LPS（1μg/mL） 和不同濃度白茶提取物 （10 μg/mL、30 μμg/mL和50 μg/mL） 共同處理細胞。24 h后采用MTT法檢測細胞相對活力。

2.6 中性紅法測定巨噬細胞吞噬活性

收集對數生長期的細胞，按1×104密度接種于96孔板。48 h后，每孔加入0.075%中性紅生理鹽水溶液100 μL，繼續培養4 h，吸取上清液，用PBS緩沖液清洗3次，每孔加入細胞裂解液（冰醋酸:乙醇=1:1） 100μL，4℃下放置2 h，待細胞裂解后測定吸光度值OD（波長為540 nm）。

2.7 NO試劑盒檢測炎癥因子NO的分泌情況

將RAW264.7細胞株系以1×104密度接種于96孔板，模型組LPS誘導炎癥，按上述分組處理細胞。24 h后，用NO試劑盒檢測NO濃度，按照說明書操作，最后用酶標儀檢測吸光度值（波長為540 nm）。

2.8 iNOS和Il-6基因表達的測定

提取細胞的總RNA，將RNA反轉錄成cDNA，熒光定量qPCR檢測炎癥因子iNOS和Il-6 mRNA基因表達。各待測基因mRNA序列從NCBI中獲取，引物由primer 6設計，按表1合成。并按20 μL反應體系：SYBR Green Mix 10 μL，Rox 0.4 μL，上下游引物各 0.4 μL （10 μmol/L），cDNA 2μL，RNase-free H2O 6.8 μL；反應條件如下：95℃變性10 min；95℃30 s、60℃ 30 s、72℃ 20 s，共 40個循環；95℃ 30 s，55℃30 s，95℃30 s。每個標本均作三個復孔，復孔間的Ct值差異控制在0.5以內。

待測基因樣本的mRNA相對表達量的計算采用以下公式：

待測基因樣本mRNA相對表達量=2-△△Ct

2.9 統計方法

所有實驗重復三次，采用GraphPad Prism 7軟件分析數據，所有數據均采用平均值±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

表1 內參及目的基因熒光定量PCR反應的引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescent quantitative PCR reaction of reference and target genes

3 結果與分析

3.1 白茶提取物中主要化學成分含量

由表2可知，在白茶提取物中，茶多酚含量最高，其中2018年白茶的茶多酚含量達到了23.15%，比2014年白茶茶多酚含量高出1.91%；貯藏過程中，游離氨基酸、EGCG和EGC含量具有小幅度下降，但是咖啡堿含量基本上保持一致，這與咖啡堿是嘌呤堿雜環化合物，具有環狀結構而相對比較穩定有關；2018年白茶的黃酮含量為5.64 mg/g，2014年白茶的黃酮含量為5.98 mg/g，上升幅度為6.03%，原因可能是茶葉在貯藏過程中酚類物質發生轉化，形成了黃酮類物質[12]。

表2 白茶提取物中主要化學成分含量Table 2 Contents of main chemical components in White tea extract

3.2 RAW264.7細胞炎癥模型的建立

熒光顯微鏡下觀察RAW264.7細胞形態學結構，生長速度較快，簇狀生長，當細胞還未貼壁時，細胞呈圓形或橢圓形，其細胞質有一環“光圈”，折光透明光亮。如圖1-A所示，RAW264.7細胞傳代后可在2～4 h內貼壁，一般一小時后就可牢固貼壁了，貼壁后大多數也是呈圓形或橢圓形生長。模型組給予1μg/mL LPS刺激后，細胞會變為類似四角形或多邊形，細胞質出現顆粒性物質，并且都伸出偽足之類，胞體變大，簇狀生長消失，見圖1-B。結果與鄧延珍的研究一致[13]。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態Fig.1 RAW264.7 cells under inverted microscope

如圖2-A所示，小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 分別在 1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL和10μg/mL的LPS刺激誘導下，均能顯著提高炎癥因子NO的分泌量，且呈劑量關系，表現極顯著性差異（P＜0.05）。通過比較細胞活力大小來評估四種濃度對細胞活性的影響，如圖2-B所示，1μg/mL LPS細胞的相對活力與正常組相比相對活力相差不大，2μg/mL、5μg/mL和10 μg/mL LPS均能顯著提高細胞相對活力，對RAW264.7細胞有增殖的效果。綜合分析得出，1μg/mL LPS能夠誘導巨噬細胞RAW264.7產生炎癥反應，并對細胞活力無影響，因此選用1 μg/mL的LPS誘導RAW264.7建立細胞炎癥反應模型，這與Swirski F K實驗建模方法一致[14]。

3.3 白茶提取物對細胞活力的影響

圖2 不同濃度LPS誘導RAW264.7細胞中NO含量和細胞活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of LPS on NO content and cell viability in RAW264.7 cells A:NO content;B:Relative cell viability

MTT法可以檢測細胞存活和生長，其原理是活細胞內線粒體脫氫酶能將四氮唑化物（MTT）由黃色還原為藍色的甲臜（Formazan），后者溶于有機溶劑（如二甲基亞砜、無水乙醇或酸化異丙醇等），產量與活細胞數成正比[15]。與對照組比較，EGCG和白茶提取物對細胞相對活力沒有顯著變化，說明此實驗條件下該濃度范圍內的EGCG、白茶提取物均未對細胞的活性造成顯著影響（圖3）。

圖3 不同處理對RAW264.7細胞活力的影響Fig.3 Effects of different treatments on the viability of RAW264.7 cells

圖4 不同處理對RAW264.7巨噬細胞吞噬活性的影響Fig.4 Effects of different treatments on the phagocytic activity of RAW264.7 macrophages

圖5 不同處理對LRS誘導RAW264.7細胞NO表達的影響Fig.5 Effects of different treatments on No expression RAW 264.7 cells induced by LPS

3.4 不同處理對RAW264.7細胞吞噬活性的影響

有研究結果表明，20μmol/L的EGCG可以降低巨噬細胞的炎癥反應，并提高吞噬活性[16]。如圖4-A所示，用LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞的吞噬活性相比于正常細胞是顯著變化的，當使用不同濃度的EGCG（1 μM、5 μM、10μM和20 μM）處理時，結果發現20 μM的EGCG能夠有效提高巨噬細胞的吞噬活性。由圖4-B實驗結果表明，白茶提取物均能顯著提高RAW264.7細胞的吞噬活性，白茶提取物具有活化RAW264.7細胞，提高吞噬能力的作用，可保護機體免受抗原感染。

3.5 不同處理對LPS誘導RAW264.7細胞后NO表達的影響

EGCG具有較好的抗炎作用[17-18]。如圖5-A所示，LPS誘導RAW264.7細胞的NO釋放量顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，EGCG能夠極顯著的抑制RAW264.7細胞中NO的產生，且具有顯著性差異（P＜0.05）。采用新、陳年白茶提取物作為處理組，分別加入10 μg/mL、30 μg/mL 和 50 μg/mL 的茶葉提取物+LPS（1 μg/mL） 共同作用 RAW264.7細胞。實驗結果如圖5-B所示，新白茶提取物和陳年白茶提取物均能有效抑制RAW264.7細胞中NO的產生，且具有極顯著性差異（P＜0.05），且陳年白茶提取物的抑制效果優于新白茶提取物。白茶加工工藝簡單，經萎凋干燥制作而成，鮮葉中的多酚與咖啡堿等物質損耗較低，這些物質能抑制NF-KB信號途徑的激活下調iNOS表達[19-20]。

3.6 不同處理對LPS誘導RAW264.7細胞中炎癥因子轉錄表達的影響

誘導性一氧化氮合酶（iNOS）是調節炎癥反應的蛋白酶，細胞在正常情況下不表達，當細胞被LPS刺激活化時，炎癥反應激活，誘導細胞分泌iNOS基因表達，分泌NO炎癥因子，使炎癥程度加重[21]。如圖6所示，相比于正常組，模型組細胞中的iNOS和IL-6 mRNA水平顯著提高（P＜0.05）；50μM、100μM和20μM的EGCG濃度均可顯著抑制iNOS與iL-6在mRNA水平上的表達。如圖7所示，10 μg/mL、30μg/mL和50 μg/mL陳年白茶可降低iNOS與IL-6 mRNA表達水平，呈劑量正相關。由此可證明陳年白茶提取物高劑量組對IL-6和iNOS mRNA水平轉錄抑制作用優于吲哚美辛。從圖8所示，將相同濃度（10 μg/mL）的陳年白茶提取物和新白茶提取物對iNOS與IL-6 mRNA表達水平進行比較，發現陳年白茶提取物和新白茶提取物均能夠顯著抑制IL-6和iNOS mRNA水平轉錄，抑制效果與陽性藥物組吲哚美辛基本一致。可能是白茶中茶多酚、黃酮類和咖啡堿等活性成分共同作用的結果，其有效地抑制LPS誘導RAW264.7細胞炎癥。

圖6 EGCG對LPS誘導RAW264.7細胞中iNOS（A）和IL-6（B）基因相對表達的影響Fig.6 Effect of EGCG on the relative expression of iNOS（A） and IL-6（B） in RAW264.7 cells induced by LPS

圖7 陳年白茶提取物對LPS誘導RAW264.7細胞中iNOS（A）和IL-6（B）基因相對表達的影響Fig.7 Effect of old white tea extract on the relative expression of iNOS（A） and IL-6（B） in RAW264.7 induced by LPS

圖8 茶提取物對LPS誘導RAW264.7細胞中iNOS（A）和IL-6（B）基因相對表達的影響Fig.8 Effect of tea extract on the relative expression of iNOS （A） and IL-6（B） in RAW264.7 induced by LPS

4 結論與討論

NO作為一種生物學活性物質，除了在中樞神經系統作為重要的信號傳遞物質外，還廣泛參與了包括免疫反應在內的機體多系統的生理和病理過程[22-24]，巨噬細胞受到刺激活化時，會釋放大量的NO殺死機體內病原微生物等來誘導炎癥反應以抵御外界不利因素的侵害。NO的表達是通過其上游關鍵酶iNOS來控制的。

白茶提取物中含有大量的茶多酚、氨基酸和咖啡堿等活性成分，并且通過體外實驗或體內動物實驗，都已經被證實了可以通過抑制NF-KB通路的激活而表現出來一定程度的抗炎功效[3,5,16,20]。試驗結果表明白茶提取物能夠抑制RAW264.7細胞中NO的產生，且具有極顯著性差異（P＜0.05），呈劑量依賴性，并且陳年白茶提取物的抑制效果優于新白茶提取物；通過進一步檢測白茶提取物對NO的上游關鍵酶iNOS mRNA表達和促炎因子IL-6的mRNA表達的影響，發現白茶提取物能夠顯著抑制IL-6和iNOS mRNA水平轉錄，抑制效果與陽性藥物組吲哚美辛相比基本一致。

本研究表明了白茶提取物能夠抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥，且陳年白茶提取物的抑制效果優于新白茶提取物。其中可能的原因為：第一，白茶制作工藝過程中多酚與咖啡堿的損耗較低，而咖啡堿與茶多酚能夠抑制NF-KB信號途徑的激活，下調iNOS表達[20]；第二，黃酮是抑制炎癥反應中的重要活性物質[25]。通過對比陳年白茶提取物與新白茶提取物生化成分發現，陳年白茶提取物中黃酮含量比新年白茶提取物含量高出6.03%，這與周瓊瓊等人[26]研究結果一致；第三，可能是白茶中茶多酚、黃酮類、咖啡堿等活性成分共同作用的結果；Ho等[27]研究表明，龍眼花提取物抑制LPS誘導RAW264.7細胞產生NO是由于多酚類、黃酮類、原花青素類等共同作用的結果，而不僅僅是單一的酚類物質。

本試驗僅進行體外抗炎研究，仍需進一步的體內動物實驗進行驗證，對NF-KB蛋白p65、NF-KB p50蛋白的表達影響等還需要進一步研究以便開發白茶提取物的抗炎活性功效。綜上所述，本實驗初步探討白茶提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥的影響，發現白茶提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥具有一定的抑制作用，這對今后研究白茶提取物抗炎功效，為后續研究老年衰退性疾病、代謝綜合征和白茶功效研究等提供參考。