RNA干擾技術及其應用

(聊城大學 山東 聊城 252000)

一、RNA干擾的發現

Rich Jorgensen在1990年研究轉基因矮牽牛如何改變花色的時候發現了一個現象：當導人色素外源基因時并沒有產生預期設想的花色加深，反而出現花色斑駁。Rich Jorgensen考慮出現這個現象的原因是某些色素的缺失所致。這就提示，導入的基因和牽牛花內源的著色基因都被抑制，也正因為如此，當時把這種現象稱“共抑制[1]”(CO-suppression)。相似的現象也在線蟲中發現，稱為“靜息作用”(quelling)。1995年，康乃爾大學的Guo[2]等曾經嘗試用反義RNA去阻斷線蟲的par-1基因表達，結果發現反義RNA的確能阻斷目的基因的表達，但作為對照的正義RNA，雖不能與活性RNA結合，也照樣能引發抑制。1998年，Fire[3]和Tabara首次將雙鏈RNA(double-strandRNA，dsRNA)正義鏈與反義鏈的混合物注入線蟲，結果表現出比單獨注入單鏈要強得多的沉默，并且導致子一代同源基因的沉默，這也是人們第一次應用RNAi技術。事實上，即使每個細胞只注入幾個分子的dsRNA也足以引起抑制。隨后Hammond還發現，不僅在線蟲中，在果蠅中也存在dsRNA誘導的基因沉默，而且在它們的后代中依然表現沉默，并將這種現象稱為RNAi。這種雙鏈RNA導致的RNA干擾現象隨后在昆蟲、錐蟲、果蠅、渦蟲、斑馬魚、真菌、植物擬南芥等生物及哺乳動物細胞株中也分別被發現。2001年Elbashir等[4]用siRNA率先在哺乳動物培養的細胞中誘導特異性基因沉默，從而開始了RNAi技術在哺乳動物細胞中的研究應用。2002年，Brummelkamp等首次成功構建了小發夾RNA表達載體，并發現轉染該載體可特異性、有效地降低目的基因表達，為RNAi技術在基因治療中的應用研究奠定了基礎[5]。

二、RNA干擾的作用機制

RNAi是雙鏈介導的序列特異性的轉錄后基因沉默。作用過程可以分為啟動階段、效應階段、擴增和擴散階段四個階段。

啟動階段：指dsRNA進人細胞后，被Dicer酶特異性識別，以一種ATP依賴的方式裂解成21-23個核苷酸的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)。效應階段：這一階段是指siRNA雙鏈與Dicer酶的雙鏈RNA結合成RNA對沉默復合物進行誘導。當沉默復合物被激活后，通過解螺旋酶的作用將核苷酸的小干擾RNA的雙鏈分開，隨后在特異的位點切割目的基因mRNA，最終降解目的基因mRNA。擴增、擴散階段：這一階段是指核苷酸的小干擾RNA的反義鏈與目的mRNA結合會激活RNA依賴的RNA聚合酶介導的單鏈RNA的合成，導致雙鏈RNA大量產生，而這些雙鏈RNA雙被切割成許多小干擾RNA，這些小干擾RNA被循環利用，因此，只需少量的雙鏈RNA就能誘發整個生物體的基因沉默[6-9]。這是RNAi經典的在基因轉錄后水平發揮作用的機制。近年來，大量研究證明，在轉錄水平和翻譯水平上也存在RNAi現象。在轉錄水平，siRNA可以直接與其互補的DNA序列結合，這樣可以提高該DNA的甲基化水平，進而阻止靶標基因的轉錄。而在蛋白水平上，RNAi現象則是由另一類長19-21個核苷酸的小分子RNA，即具有單鏈結構的microRNA(miRNA)發揮作用。首先，細胞核中的miRNA基因的初級轉錄產物pri-miRNA被RNase III Drosha酶識別、結合并切割，產生miRNA前體即pre-miRNA經過初步的剪切后，pre-miRNA進入胞質。由另一種RNase III Dicer酶識別并進一步切割成類似siRNA的成熟miRNA，該miRNA能指導RISC復合物的組裝，使其結合目標mRNA的3’端非翻譯區，從而引起靶基因的降解或翻譯抑制miRNA的前體加工還存在不依賴Dicer的其他途徑，也可以達到沉默基因的功能。

三、RNAi的特點

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是生物基因組抵抗病毒或轉座子之類的外來遺傳元件入侵的一種保護性機制，RNAi具有4個重要特征：(1)高效性：少量的雙鏈RNA(dsRNA)就可以使相應的基因表達受到抑制，即其發生過程中有正反饋的信號放大效應；(2)高特異性：雙鏈RNA(dsRNA)可以特異地降解與之序列相對應的單個內源基因的mRNA無關基因不受影響；(3)可遺傳性及遠距離效應：RNAi基因表達的效應不僅能夠傳遞給子一代,而且可以在同一個生物體的不同細胞甚至生物體間進行長距離的傳遞和維持；(4)ATP依賴性：RISC的形成和Dicer酶切割dsRNA的過程中都需要ATP的參與；因此,RNA干擾想要發生效應則必須要依賴ATP的參與。此外，RNA干擾技術與傳統的技術相比，難度低，費用低，試驗周期較短，操作簡單，效果明顯，且RNA干擾還有對mRNA的切割位點確定性高、對細胞調控系統無影響，作用快速等特點。

四、RNAi技術的應用

(一)功能基因組的研究

在功能基因組研究中，需要對特定基因進行敲除，以確定其功能。由于幾乎所有包含已知基因編碼序列的dsRNA都能在體外特異性抑制該基因的功能，產生類似基因敲除的效果。因此RNAi已作為一種新型的反向遺傳學技術，成為功能基因組研究的重要工具。它與傳統的基因剔除技術相比具有投入少、周期短、操作簡單等優勢。在基因的研究中，首先利用此技術剔除待研究的目標基因，然后通過細胞表型改變的觀察、免疫蛋白印跡、免疫熒光等方法對基因的表達及功能進行分析。迄今為止，RNA干擾技術在真菌、植物、線蟲、果蠅及哺乳動物的基因功能研究中發揮了重要作用。

(二)疾病治療方面的應用

1.抗病毒治療的應用

(1)Jacque等針對HIV-1基因的不同區域，將人工合成的各種21個核苷酸siRNA或表達siRNA的質粒與HIV-1共轉染CD4的HeLa細胞后，能特異性地降解HIV-1基因組RNA，從而干擾了HIV復制周期中的早期事件，防止了病毒反轉錄中間體的生成和前病毒確立。同樣的效果在原代培養的淋巴細胞中也得到了實現[10]。Martinez等根據HIV-1進入細胞需要趨化因子輔助受體CXCR4或CCR5的特點，特異地設計了針對該輔助受體的siRNA。siRNA轉染U87-CD4細胞后，不影響CD4的表達，但能有效抑制相應的CxCR4或CCR5的表達。用X4(NIA-3)或R5(BaL)HIV-1株攻擊相應轉染細胞，發現細胞能有效阻斷急性感染，并且抑制了HⅣ-1復制。siRNA的基因沉默功能已成為干擾HIV-1的新策略。

(2)脊髓灰質炎病毒是一種快速復制、能高度溶解細胞的RNA病毒，Gidin等以此作為研究siRNA對病毒復制能力影響的模型[11]。他們人工合成了針對該病毒殼序列(SiC)和聚合酶序列(SiP)的siRNA，轉染HeLaS3和鼠成纖維細胞后進行病毒攻擊。實驗發現，轉染細胞完全抑制了病毒噬菌斑的形成，抑制了病毒的復制，明顯減少了子代病毒的滴度，并能促進絕大多數感染細胞清除病毒。通過對逃逸病毒的序列分析，發現細胞所獲得的保護作用是siRNA針對病毒靶基因組起作用的直接結果，siRNA誘發了胞內特異的抗病毒效應。

(3)呼吸道合胞病毒(Rsv)是引起嬰幼兒病毒性下呼吸道感染最重要的病原體，為胞質生活的單負鏈ILNA病毒。Bitko和Batik針對RSV基因組特定的基因，人工合成了序列特異的siRNA，轉染病毒感染的細胞后，能有效地降解病毒特定基因的mRNA，實現了對胞質特定RNA基因的沉默。

2.遺傳病治療的應用

美國西北大學的Carthew R W和日本基岡研究所的Ishizuka A等“發現RNAi同脆性x染色體綜合征(與FMR-1基因異常有關的導致智力低下的染色體病)之間的關系密切，揭示了與RNAi相關機制的缺陷可能導致人類疾病的病理機制。遺傳性疾病的RNAi治療成為當今研究RNAi的又一大熱點。

3.腫瘤病治療的應用

腫瘤是多個基因相互作用的基因網絡調控的結果。傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長。而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性。設計針對這一區段序列的dsRNA分子。只注射一種dsRNA即可以產生多個基因同時剔除的表現。也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關的基因同時剔除。Maen等應用RNAi技術成功地阻斷了MCF7乳腺癌細胞中一種異常表達的與細胞增殖分化相關的核轉錄因子基因Sp1的功能。

(三)RNAi與植物病毒病害研究

RNA干涉已被證實是一種特異、高效、經濟的使基因表達受抑的技術手段。它可有效地將靶基因的表達水平降到一個低的水平，甚至于完全的清除。早于1985年，Sanford與Johnston二位學者就已經提出”病原體衍生抗病性(pathogen derived resistance，PDR)”的觀念，證實將病毒基因轉入植物中可以使得植物產生對于該病毒的抗病性，其背后的分子機制即為RNAi。而后陸續發現煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、煙草蝕刻病毒等病毒外鞘蛋白基因可用于轉殖植物而誘發對于該病毒的抗性，接著又發現其實不需要整個基因或完整蛋白的表達，僅需一部份的RNA序列也可以造成植物對于病毒的抗性，甚至可將多種病毒的RNA片段構筑于同一載體，共同轉入植物中，即可造成該植物對于多種病毒的抗性。研究發現許多轉基因植物抗病毒的分子機制其實質為RNAi的作用，并進而發現RNAi的作用其實在動物與植物多年的演化過程中，已成為對抗病原感染時的一種內生性防御機制，同時亦在生物體生長、發育與分化的調控過程中，擔任重要的角色。將病毒在復制中起關鍵作用的基因作為目標，設計dsRNA導入植株培育出抗病毒植株來抑制病毒的復制，培育抗病毒植株[12]。

除了抗病毒機制方面的研究，RNAi現象揭示了植物病毒引起植物病征表現如花葉、黃化、葉片卷曲、變形、植株矮化、叢生等的過程。目前已知寄主的病征表現與RNAi作用及其抑制息息相關。寄主植物通過RNAi機制造成病毒RNA的降解，而RNA病毒會演化出對抗RNAi作用的抑制物，而促進病毒RNA的復制。近年來對RNAi的研究發現許多的RNA病毒基因體中都帶有RNAi的抑制物，這些病毒所攜帶的RNAi作用抑制物可抑制其寄主內生性的RNAi作用，進而造成寄主細胞生理或分化作用時的不正常，表現出卷葉、絲狀葉等畸形病征。

五、RNA干擾技術的展望

RNAi沉默機制的高效性、特異性及穩定性使這項技術成為生物醫學領域一次劃時代的革命。它的出現給基因功能研究、生物基因工程、醫藥研究提供了一種全新的方法。總之，RNA干擾在各種基因沉默現象中的所起的巨大作用預示著RNA干擾技術將廣泛被用于各種領域。RNAi不但是研究基因功能的一種有用工具，而且為特異性基因治療提供了新的技術手段，RNA干擾技術具有巨大的科研價值和社會經濟價值。雖然RNAi的分子機制已被初步了解，并較為成功地用于基因功能、疾病治療等研究方面。但仍有許多問題還需進一步探索。