黃柏鹽的制備及其抗氧化抗菌性能研究

高天成 ，孫 權，唐 娜 ，楊亞茹

（1.天津科技大學 化工與材料學院，天津 300457；2.天津海洋資源與化學重點實驗室，天津 300457；

3.天津長蘆海晶集團有限公司，天津 300457；4.天津科技大學 食品生物技術教育部工程研究中心，天津 300457）

鹽是人類日常生活的必需品，近年來國內外關于鹽產品的多角度開發取得了一定進展。在食品領域，多品種鹽主要包括竹鹽、菇鹽、海藻鹽等，多品種食用鹽滿足了不同消費群體對食鹽市場高、中、低端的各種需求；在化妝品領域，各種美容、護膚、潔面鹽也在逐步受到廣大消費者的青睞。然而，絕大部分多品種鹽以精制鹽作為載體，卻忽略了富含多種礦物質元素的海鹽［1］。隨著人們對安全隱患的重視，純天然護膚品深受消費者的青睞，因此開發純天然的護膚美容鹽成為國內外學者研究的熱點。

黃柏為蕓香科植物黃檗的干燥樹皮，來源廣泛。現代藥理學研究證明，黃柏具有抗菌、消炎、抗衰老、抗癌等藥理作用，黃柏藥理作用的活性成分主要包括總生物堿、小劈堿、黃柏堿、多酚化合物以及類黃酮等［2］。安健等［3］從黃柏中提取出鹽酸小劈堿，并對其抗菌性能進行了研究，結果表明黃柏提取成分鹽酸小劈堿對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌均具有較好的抗菌性能，抑菌率達到70%以上。李慎新等［4］研究了黃柏、連翹等5種中藥植物的抗氧化活性，結果表明黃柏的乙醇提取物具有較強的抗氧化能力，主要是黃柏中黃酮類化合物及酚類化合物等活性成分發揮抗氧化作用。根據《雷公炮炙論》記載：“中藥經鹽制后，具有增強補肝腎、潤下利水、滋陰降火的作用，可緩和中藥的辛燥之性。”本研究以優質日曬海鹽為載體，配以天然中草藥黃柏的有效成分制備黃柏美容鹽，對其抗氧化性、抗菌性等功效進行研究，為今后植物鹽護膚品的多角度開發與利用提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

黃柏，貴州云峰藥業有限公司；日曬海鹽，天津長蘆漢沽鹽場公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、三羥甲基氨基甲烷，美國Sigma-Aldrich公司；蘆丁、沒食子酸、福林酚、左旋多巴、L-酪氨酸、N-琥珀酰-L-三丙氯酸-對硝基苯胺、酪氨酸酶、彈性蛋白酶、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

S220型pH計，美國梅特勒-托利多公司；SPECORD 210 PLUS型紫外可見分光光度計，德國耶拿分析儀器公司；SY-5000旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃柏鹽的制備

以日曬海鹽為基料，配以天然中草藥植物（黃柏）提取液，制備黃柏美容鹽。首先，稱取10 g片狀的黃柏（干燥）放入1 L乙醇（75%）中浸泡，放置于75 ℃的水浴恒溫振蕩器中振蕩2 h，靜置24 h后進行過濾處理，制得質量濃度為0.677 g/L的黃柏提取液。然后，將日曬海鹽溶解后真空抽濾，濾液經過加熱后蒸發結晶，制備重結晶鹽。最后，量取一定體積0.677 g/L的黃柏提取液與一定質量的重結晶鹽混合均勻，混合液在旋轉蒸發儀中經過減壓蒸餾后，即可實現乙醇的回收，剩余的淡黃色晶體即黃柏鹽。

1.2.2 黃柏鹽中離子檢測

Ca2+、Mg2+采用EDTA絡合滴定法測定，Cl-采用硝酸銀容量法測定，K+采用原子吸收光譜法測定。

1.2.3 黃柏鹽中多酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法［5］測定黃柏鹽樣品中多酚的含量。量取質量濃度為100 mg/L的沒食子酸標準液0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30和0.35 mL于10 mL比色管中，加蒸餾水定容至2 mL，搖勻后加1.0 mL福林酚，4 min后加入1.0 mL 10%的碳酸鈉溶液，25 ℃水浴條件下保持2 h，測定溶液在765 nm處的吸光值。以吸光值為縱坐標，沒食子酸的質量（μg）為橫坐標，計算回歸得標準曲線為y=0.060 4x+0.049 7。樣品測定同法操作，根據標準曲線計算黃柏鹽中多酚含量。

1.2.4 黃柏鹽中類黃酮含量測定

采用三氯化鋁法［6］測定黃柏鹽樣品中類黃酮的含量。分別吸取質量濃度為100 mg/L的蘆丁標準液0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL于25 mL比色管中，分別加入1.5%的AlCl3溶液8 mL，pH=5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液4 mL，并加入50%乙醇定容到25 mL，靜置30 min。以不加蘆丁標準液為空白對照，測定溶液在415 nm處的吸光值。以吸光值為縱坐標，顯色液中蘆丁的質量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線為y=0.007x+0.109。樣品測定同法操作，根據標準曲線計算黃柏鹽中類黃酮含量。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定

吸取0.1 mL黃柏鹽樣品溶液置于5 mL試管中，加入0.9 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，室溫下避光放置10 min后于517 nm處測定樣品的吸光值A1；同法操作，用等體積蒸餾水代替黃柏鹽樣品溶液，測定吸光值A0；用等體積無水乙醇代替DPPH溶液，測定吸光值A2，用以扣除樣品本身對吸光度測定的干擾。DPPH自由基清除率=［1-（A1-A2）/A0］×100%。

1.2.6 酪氨酸酶抑制活性實驗［7］

吸取1.9 mL黃柏鹽樣品溶液置于10 mL試管中，加入1 mL 0.03% L-酪氨酸溶液，置于37 ℃的恒溫水浴中保溫10 min后加入0.1 mL酪氨酸酶溶液反應2 min，于475 nm處測定其吸光值At；同法操作，用等體積的磷酸鹽緩沖溶液代替酪氨酸酶溶液，測定吸光值A1；用等體積蒸餾水代替黃柏鹽樣品溶液，測定吸光值Ab；用等體積蒸餾水代替黃柏鹽樣品溶液，用等體積的磷酸鹽緩沖溶液代替酪氨酸酶溶液，測定吸光值A0。酪氨酸酶活性抑制率=［1-（At-Al）/（Ab-A0）］×100%。

1.2.7 抗菌性實驗

采用藥物平板稀釋法［8］，配制不同濃度的黃柏鹽樣品平板，在每個平皿中貼上浸有菌懸液的濾紙片（無菌操作），于37 ℃培養2 d，觀察測量菌落直徑。菌落直徑為3次測量的平均值，抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。抑制劑對各個生物活性抑制能力的強弱可采用抑制率來表達，但抑制率隨抑制劑濃度的變化而變化，直接采用抑制率比較抑制劑抑制能力的強弱不夠準確。目前通常采用抑制率達到50%時的抑制劑濃度（IC50）作為抑制劑抑制能力強弱的指標。

2 結果與討論

2.1 理化性質分析

表1為黃柏鹽的理化指標。由表1可以看出，以日曬海鹽作為對照，黃柏鹽中隨著黃柏含量的增加，含水量和不溶物質量分數逐漸增大。黃柏鹽的pH值也隨著黃柏含量的增加而增大，且其pH接近中性，這是因為黃柏中主要成分為小劈堿，小劈堿是一種季銨型生物堿，具有弱堿性。當化妝品的pH值和皮膚的pH值保持一致時，化妝品才能達到清潔皮膚且不破壞皮膚原有抵抗力的效果。人體皮膚的pH值約為5.5～7.0，黃柏鹽的pH接近中性，與皮膚比較接近。

表 1 黃柏鹽的理化指標Tab.1 Physical and chemical parameters of phellodendron beauty salt

日曬海鹽中含有許多人體必需的鈣、鎂、鉀等礦物元素。Ca2+能夠保護細胞膜不受破壞，還能使皮膚保持一定的彈性。Mg2+能夠修復經紫外線輻射損傷的細胞，并具有防護功能。K+能夠調節細胞內、外液的滲透壓以及酸堿平衡，活化體內若干種酶的活性，通過酶參與體內蛋白質和碳水化合物的代謝和合成。增加黃柏鹽中黃柏含量，鹽度逐漸減少，Mg2+、K+含量緩慢減小，Ca2+含量緩慢增大。

表1中4種不同配比黃柏鹽雖然各項理化指標略有差異，但是均符合《化妝品安全技術規范》（2015年版）標準，可以作為植物鹽護膚品進行開發與利用。

2.2 生理活性分析

2.2.1 黃柏鹽中多酚和類黃酮含量分析

類黃酮屬于酚類物質，多酚和類黃酮具有較好的生物活性，黃柏提取物的抗氧化性與其含量密切相關。表2為不同配比黃柏鹽中多酚和類黃酮的含量。由表2可以看出，黃柏鹽中隨著黃柏含量的增加，多酚含量和類黃酮含量逐漸增大。2.5%黃柏鹽中多酚含量和類黃酮含量較低，分別為0.119和0.029 mg/g；10%黃柏鹽中多酚含量和類黃酮含量較高，分別為0.256和0.181 mg/g。

表 2 不同配比黃柏鹽中多酚和類黃酮的含量Tab.2 Co ncents of polyphenols and flavonoids in different phellodendron beauty salts

2.2.2 黃柏鹽對DPPH自由基的清除作用

分別對2.5%，5%和10% 3種不同黃柏含量的黃柏鹽樣品進行DPPH自由基清除能力測定，結果如圖1所示。

由圖1可知，不同配比黃柏鹽對DPPH自由基均具有一定的清除效果，且黃柏鹽中黃柏含量的高低與DPPH自由基清除率呈正相關關系。3種配比黃柏鹽樣品中，2.5%黃柏鹽清除作用最弱，抑制率達到50%時的IC50為363.64 g/L；10%黃柏鹽清除作用最強，IC50為124.83 g/L。自由基在體內過度累計，富集于脂質細胞膜周圍，引起脂質過氧化，這是造成人體衰老的主要原因。該黃柏鹽中所含有的多酚和類黃酮具有較強的抗氧化活性，能夠清除體內游離的自由基，有效地阻止脂質過氧化反應的進行，絡合金屬離子，具有延緩衰老的功效［9,10］。

2.2.3 黃柏鹽對酪氨酸酶的抑制活性

分別對2.5%，5%和10% 3種不同黃柏含量的黃柏鹽樣品進行酪氨酸酶抑制活性實驗測定，結果如圖2所示。

由圖2可知，不同配比黃柏鹽對酪氨酸酶都具有一定的抑制作用，2.5%和5%黃柏鹽的抑制作用相差不大，IC50分別為304.51和254.36 g/L。隨著黃柏含量的增大，抑制效果越來越顯著，3種配比黃柏鹽樣品中，10%黃柏鹽對酪氨酸酶的抑制效果最佳，IC50為147.04 g/L。酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下會生成黑色素，過多的黑色素累積會使皮膚表面出現各種黑斑。黃柏鹽可以有效地抑制酪氨酸酶的活性，具有一定的祛除黑色素的功效，起到美膚效果。

2.2.4 黃柏鹽的抗菌性

分別采用2.5%，5%和10% 3種不同黃柏含量的黃柏鹽樣品，使用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行抑菌實驗，結果如圖3所示。由圖3可知，黃柏鹽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有一定的抗菌性能，對金黃色葡萄球菌的抗菌性優于大腸桿菌。10%黃柏鹽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的IC50分別為131.58和159.69 g/L。這是因為黃柏中的小劈堿、多酚和類黃酮均具有良好的抑菌性［11］。

3 結論

1） 研究了不同配比黃柏鹽樣品的理化性質和生理活性，最終確定黃柏鹽中的黃柏較佳質量分數為10%。隨著黃柏質量分數的增加，含水量和pH值逐漸增加，且其pH接近中性。

2） 黃柏質量分數的高低與DPPH自由基清除率呈正相關性，該樣品鹽對DPPH自由基清除率的IC50為124.83 g/L。

3） 不同配比黃柏鹽對酪氨酸酶都具有一定的抑制作用，隨著黃柏質量分數的增加，抑制效果越來越顯著；對酪氨酸酶的IC50為124.83 g/L。

4） 黃柏鹽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有一定的抗菌性能，對金黃色葡萄球菌的抗菌性優于大腸桿菌。對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的IC50分別為131.58和159.69 g/L。