植物精油的抑菌性探究及其在化妝品中的應(yīng)用

桂雨豪，孟 瀟，陳慶生，龔盛昭,

（1.廣州環(huán)亞化妝品科技有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300）

化妝品中的防腐體系是化妝品設(shè)計(jì)中重要的一環(huán)，防腐劑不但能抑制細(xì)菌、霉菌和酵母菌的新陳代謝，而且影響其生長和繁殖。化妝品中的防腐劑主要從以下幾個(gè)方面發(fā)揮作用：破壞微生物細(xì)胞壁或抑制微生物細(xì)胞壁的形成；影響 細(xì)胞膜的功能；抑制蛋白質(zhì)合成和致使蛋白質(zhì)變性［1-3］。隨著社會(huì)的發(fā)展以及消費(fèi)者對于產(chǎn)品安全性要求的不斷提高，傳統(tǒng)防腐劑在化妝品中的安全性問題受到廣泛關(guān)注， 消費(fèi)者更加傾向于溫和、無刺激、環(huán)保的化妝品。

植物精油是從植物的花、葉、莖、根或果實(shí)中，通過水蒸氣蒸餾法、擠壓法、冷浸法 或溶劑提取法提煉萃取的揮發(fā)性芳香物質(zhì)，主要由萜烯類、 醛類、醇類、酯類等化學(xué)分子構(gòu)成［4］。研究報(bào)道［5］稱，植物精油具有廣譜的抗微生物活性，能夠抑殺細(xì)菌、真菌和病毒。由于精油對微生物的作用可能有多個(gè)作用位點(diǎn)，因此精油的抗菌作用機(jī)制非常復(fù)雜［6］。基于此，本文選擇6種化妝品常用精油，探究其在化妝品防腐體系中的作用，為精油的應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

白色假絲酵母菌（ATCC10231）、金黃色葡萄球 菌（ATCC6538）、大腸桿菌（ATCC8739）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）、黑曲霉（ATCC16404），廣東省微生物菌種保藏中心（廣東省微生物研究所）；MH（Mueller Hinton）瓊脂修飾培養(yǎng)基、PDA（Potato Dextrose Agar）修飾培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；肉桂精油、迷迭香精油、檀香精油、玫瑰精油、茶樹精油、甜橙精油，德國DROM公司；甘油，德國EMERY公司；丁二醇，OXEA公司；EDTA-二鈉，荷蘭AKZONOBEL公司；卡波姆，美國LUBRIZOL公司；黃原膠，美國COKELCO公司；氫化聚癸烯，美國MOBIL公司；ARLACEL 165，德國BASF公司；聚二甲基硅氧烷，美國DOW CORING公司；ACNIBIO AP，瑞士CLARIANT公司；綿羊紅細(xì)胞懸液，廣州市藥品檢驗(yàn)所藥理室；潔凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技儀器有限公司；霉菌培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫恒濕箱，施都凱儀器設(shè)備上海有限公司。

其中，實(shí)驗(yàn)所用MH瓊脂修飾培養(yǎng)基是在MH培養(yǎng)基中加入0.5%的Tween-20和1.5%的瓊脂后高溫滅菌配制；PDA修飾培養(yǎng)基是在PDA培養(yǎng)基中加入0.5%的Tween-20后經(jīng)高溫滅菌配制；ARLACEL 165由PEG-100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯組成；ACNIBIO AP由苯氧乙醇、羥苯甲酯、羥苯丁酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯異丁酯組成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 6種精油的抑菌性試驗(yàn)

選擇6種精油（玫瑰精油、迷迭香精油、檀香精油、肉桂精油、茶樹精油、甜橙精油）進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌試驗(yàn)按照以下方法進(jìn)行。

抗細(xì)菌活性研究：將MH修飾培養(yǎng)基瓊脂熔化，分別將6種精油加入到MH瓊脂培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基表面與培養(yǎng)皿最上層邊緣高度差值為（3±0.2）mm（可使培養(yǎng)基上層蒸汽壓控制在較高的范圍內(nèi)，最大程度減少精油的揮發(fā)，削弱該因素對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的不可控影響），再用帕拉膠膜將平皿的邊緣密封好。每種精油均配制成如下體積分?jǐn)?shù)：0，0.016%，0.032%，0.064%，0.096%，0.128%，0.250%，0.50%和1%。在平皿上每孔分別添加0.2 mL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的菌懸浮液，使受檢樣品最終含菌量的數(shù)量級達(dá)到105或106CFU/g，每組精油每個(gè)體積分?jǐn)?shù)做3個(gè)平行，分別置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在接菌后的第1和7天取樣分析樣品中的菌落含量。

抗真菌活性研究：將PDA修飾培養(yǎng)基熔化，分別將6種精油加入PDA培養(yǎng)基中，使每種精油均配制成如下體積分?jǐn)?shù)：0，0.016%，0.032%，0.064%，0.096%，0.128%，0.250%，0.50%和1%。在平皿上每孔分別添加0.2 mL黑曲霉、白色假絲酵母的菌懸浮液，使受檢樣品最終含菌量的數(shù)量級達(dá)到105或106CFU/g，并用帕拉膠膜將平皿的邊緣密封好，每組精油每個(gè)體積分?jǐn)?shù)做3個(gè)平行，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在接菌后的第7和28天取樣分析樣品中的菌落含量。

1.2.2 基礎(chǔ)膏霜的制備

將水相加熱到80 ℃。將防腐劑加入油相中加熱至80 ℃，攪拌至均勻。將油相倒入水相，9 000 r/min乳化3 min，冷 卻至40 ℃后出料。膏霜具體配方如表1所示。

表 1 膏霜基質(zhì)配方Tab.1 The cream formulation

1.2.3 不添加精油的膏霜防腐挑戰(zhàn)測試

以上述膏霜為基質(zhì)配方，按照0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%和0.3%的防腐劑添加量進(jìn)行制作，制作完成后，備用。

實(shí)驗(yàn)參考《中國藥典》（2010年版，二部，附錄XIX N）的微生物性能測試方法，分別用上述添加不同含量防腐劑的樣品挑戰(zhàn)一次加菌的28 d防腐性能測試。稱取受試樣20 g，分別添加0.2 mL混合細(xì)菌菌懸液和混合真菌菌懸液，使受檢樣品最終含菌量的數(shù)量級達(dá)到105或106CFU/g，攪拌均勻，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。在接菌后的第2，7，14和28天取樣分析樣品中的含菌量。

防腐測試判定標(biāo)準(zhǔn)為：在第7天時(shí)細(xì)菌菌落總數(shù)要求下降99.9%，在第7，14和28天持續(xù)下降；真菌總數(shù)在第7～28天不再出現(xiàn)。

1.2.4 添加精油的膏霜防腐挑戰(zhàn)測試

根據(jù)1.2.1試驗(yàn)方法，選擇具有較好抗菌活性的精油，添加在1.2.3中所述的6種不同防腐劑含量的膏霜配方中，攪拌均勻，備用。挑戰(zhàn)一次加菌的28 d防腐性能測試，試驗(yàn)菌種、檢測標(biāo)準(zhǔn)、樣品檢測周期、測試方法以及評判標(biāo)準(zhǔn)與1.2.3所述一致。

1.2.5 皮膚刺激性試驗(yàn)

將未添加精油的膏霜、添加精油的膏霜以及未添加任何防腐劑的空白膏霜進(jìn)行皮膚刺激性對比試驗(yàn)。皮膚刺激性的測定是基于人體皮膚表面的脂類和蛋白與紅細(xì)胞的細(xì)胞膜相似的原理，通過測定從紅細(xì)胞中釋放的血紅蛋白量及其變性程度來評價(jià)細(xì)胞膜和蛋白的損傷，反映皮膚刺激性的大小［7-9］。

具體試驗(yàn)方法如下：在離心管中分別加入500 μL不同含量（用PBS進(jìn)行稀釋）的樣品溶液和500 μL 2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的綿羊紅細(xì)胞懸液，充分混勻。每個(gè)含量梯度均設(shè)置3個(gè)平行，以PBS為陰性對照（完全不溶血），以100 mg/L的SDS溶液為陽性對照（完全溶血）。置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h后，以2 000 r/min離心3 min，取上清液于酶標(biāo)儀410，540和575 nm處測定吸光度值A(chǔ)樣品組410/540/575，A陽性對照組410/540/575和A陰性對照組410/540/575。按如下公式分別計(jì)算樣品的溶血率和蛋白變性指數(shù)（DI）。

根據(jù)溶血率作圖確定回歸方程，計(jì)算測試樣品引起紅細(xì)胞50%溶血時(shí)的樣品質(zhì)量濃度HC50（mg/L）以及樣品體系分?jǐn)?shù)為1%時(shí)的蛋白質(zhì)變性指數(shù)DI。由HC50值和DI值計(jì)算樣品的L/D值：L/D=HC50/DI。依據(jù)歐洲替代方法驗(yàn)證中心（ECVAM）的Red Blood Cell（RBC）實(shí)驗(yàn)測試方法及分級標(biāo)準(zhǔn)［10］，對測試樣品刺激性程度進(jìn)行分級，如表2所示。

表 2 化妝品產(chǎn)品刺激性分級標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 The classification criteria of skin irritation for cosmetics

2 結(jié)果與討論

2.1 6種精油抗菌試驗(yàn)結(jié)果

6種精油的抗細(xì)菌最低抑制體積分?jǐn)?shù)如表3所示，抗真菌最低抑制體積分?jǐn)?shù)如表4所示。

由表3可以看出，6種精 油中，對于細(xì)菌的抑制作用最好的是肉桂精油，甜橙精油、玫瑰精油、檀香精油的抑菌效果相當(dāng)，迷迭香精油只有微弱的抑菌效果，而茶樹精油在該試驗(yàn)體積分?jǐn)?shù)下無抑菌作用，同時(shí)，精油對不同類型的細(xì)菌抑制效果存在差異，對革蘭氏陽性菌的抑制效果要優(yōu)于革蘭氏陰性菌，可能是因?yàn)楦锾m氏陰性菌的細(xì)胞壁外有一層膜，限制了疏水性物質(zhì)在細(xì)胞壁脂多糖中的 擴(kuò)散。

表 3 6種精油抗細(xì)菌最低抑制體積分?jǐn)?shù)Tab.3 The minimum inhibitory volume fraction against bacteria of six essential oils

表 4 6種精油抗真菌最低抑制體積分?jǐn)?shù)Tab.4 The minimum inhibitory volume fraction against fungus of six essential oils

由表4可以看出，對于真菌的抑制作用最好的是肉桂精油，其次是甜橙精油和玫瑰精油，迷迭香精油和檀香精油體現(xiàn)出微弱的抑制真菌的作用，茶樹精油在該體積分?jǐn)?shù)下無抑菌效果。從對霉菌和酵母菌的不同抑制效果可以看出，精油對不同類型的真菌抑制效果存在差異，對酵母菌的抑制效果要優(yōu)于霉菌。

不同類型的精油之間成分存在著較大的差異，肉桂精油中醛類占總含量的87%左右［11］，檀香精油的主要成分是檀香醇［12］，玫瑰精油中香茅醇的含量占90%左右［13］，甜橙精油主要成分是檸檬烯，達(dá)到了78%左右［14］，這些成分均能抑制細(xì)菌和真菌的生長，主要成分為醛類的精油抑菌效果較好。

2.2 不添加精油的膏霜防腐挑戰(zhàn)結(jié)果

添加6個(gè)不同防腐劑含量梯度的膏霜防腐挑戰(zhàn)結(jié)果如表5所示。

表 5 不添加精油膏霜防腐挑戰(zhàn)測試結(jié)果Tab.5 The anticorrosion challenge test results of the cream without essential oil

由表5可以看出，未添加精油的膏霜在防腐劑含量為0.25%以上才能達(dá)到較好的防腐效果。

2.3 添加精油的膏霜防腐挑戰(zhàn)結(jié)果

根據(jù)1.2.1的抑菌試驗(yàn)，選擇抗菌效果較好的肉桂精油加入1.2.2所述的膏霜體系，考慮到實(shí)際生產(chǎn)成本，添加量定為0.01%，配方中其余含量均不變，防腐挑戰(zhàn)結(jié)果如表6所示。

對比表5和6可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膏霜中不添加任何防腐劑時(shí)，只添加0.01%的肉桂精油不能達(dá)到安全的防腐效果。當(dāng)膏霜中添加了0.01%肉桂精油后，防腐劑的含量在0.15%就可以達(dá)到良好的防腐效果，這說明在化妝品中添加精油能夠大大降低防腐劑的使用量，精油對防腐劑有協(xié)同增效的作用。而防腐劑是化妝品中主要的過敏源和刺激源，因此，在化妝品中添加精油在降低防腐劑用量的同時(shí)也減輕了化妝品過敏、產(chǎn)生刺激的風(fēng)險(xiǎn)。

表 6 添加0.01%肉桂精油的膏霜防腐挑戰(zhàn)測試結(jié)果Tab.6 The anticorrosion challenge test results of the cream with 0.01% cinnamon essential oil

2.4 皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果

以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，紅細(xì)胞溶血率為縱坐標(biāo)作圖并確定回歸方程。根據(jù)回歸方程確定樣品引起紅細(xì)胞50%溶血時(shí)的質(zhì)量濃度HC50，同時(shí)計(jì)算出1%樣品體積分?jǐn)?shù)下的蛋白質(zhì)變性指數(shù)DI，得出L/D，根據(jù)表2，確定樣品的刺激程度，試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

表 7 皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 The results of skin irritation test

由L/D值可以看出，未添加任何防腐劑和精油的膏霜刺激性最低，添加了0.25%防腐劑而未添加精油的膏霜有輕微的刺激性，在膏霜中添加0.01%精油降低了膏霜中防腐劑的使用量，因此其L/D＞100，無刺激性，這說明在化妝品中精油的抑菌效果在降低防腐劑用量的同時(shí)，也降低了化妝品的刺激性。對比樣品1和樣品3，樣品3的L/D值比樣品1低，這說明精油對皮膚具有輕微的刺激性。

3 結(jié)論

通過研究6種精油的抗菌性，發(fā)現(xiàn)對細(xì)菌抑制作用最好的是肉桂精油，甜橙精油、玫瑰精油、檀香精油的抑菌效果相當(dāng)，另外，精油對革蘭氏陽性菌的抑制作用要優(yōu)于革蘭氏陰性菌。對真菌抑制作用最好的是肉桂精油，其次是甜橙精油和玫瑰精油，迷迭香精油和檀香精油體現(xiàn)出微弱的抑制真菌的作用，精油對不同類型的真菌的抑菌性也存在差異，對酵母菌的抑菌性要優(yōu)于霉菌。精油的抗菌性與其化學(xué)成分有很大的關(guān)系，主要成分為醛、醇類的精油大多具有好的抑菌作用。

通過對比未添加精油的膏霜和添加0.01%肉桂精油膏霜的防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在膏霜中添加0.01%的肉桂精油可以有效地降低膏霜中防腐劑使用量。通過皮膚刺激性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在均能通過防腐測試的前提下，添加了0.01%肉桂精油和0.15%防腐劑的膏霜L/D值為112.26，而只添加了0.25%防腐劑的膏霜L/D值為58.53，說明在化妝品中添加精油，在降低了防腐劑用量的同時(shí)，也降低了化妝品的刺激性。但是，當(dāng)防腐劑用量均為0.15%時(shí)，添加了0.01%肉桂精油的膏霜L/D值比未添加的膏霜L/D值略低，這說明精油本身具有輕微的刺激性。