獐牙菜苦苷對MGC803細胞的體內外抑制作用*

楊偉強 萬伯順# 常 慶

上海市嘉定區中心醫院外科1(201800) 中心實驗室2

背景：胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，抑制胃癌細胞增殖是抗癌藥物研發的關鍵。目的：研究獐牙菜苦苷在體內外對MGC803細胞增殖的影響。方法：MGC803細胞予以不同濃度獐牙菜苦苷(0、30、60、90 μg/mL)培養48 h，以MTT法檢測細胞活性，Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡率，ELISA法檢測Bax、Bcl-2含量。建立BALB/c裸鼠MGC803移植瘤模型，尾靜脈注射不同濃度獐牙菜苦苷(0、40、60、80 mg/kg)，腫瘤體積長至1 000 mm3時處死裸鼠，記錄裸鼠開始和最終的體質量，以免疫組化法檢測Ki-67蛋白表達。結果：與對照組相比，不同濃度獐牙菜苦苷可有效抑制MGC803細胞增殖，誘導細胞凋亡，Bax含量明顯升高，Bcl-2含量明顯降低(P<0.05)。在MGC803細胞裸鼠移植瘤模型中，不同濃度獐牙菜苦苷組的腫瘤體積較對照組明顯縮小(P<0.05)，Ki-67蛋白表達明顯減少(P<0.05)。結論：獐牙菜苦苷是一種安全有效的抗胃癌的植物單體。

消化系統腫瘤是臨床上最常見的惡性腫瘤，其中胃癌的發病率較高，發現時往往已處于較晚期，患者的總體預后不良[1]。目前胃癌的治療以手術切除并配合術后放化療為主，但目前手術切除并不能保證完全清掃，且主流放化療藥物的療效欠佳，毒副作用相對較大。異常的凋亡減少是胃癌發生、發展的重要因素之一，尋找新的化合物誘導胃癌細胞凋亡仍是目前臨床工作的探索熱點[2]。獐牙菜苦苷屬于裂環環烯醚萜苷類化合物，廣泛存在多種植物中[3-5]。既往藥理學研究證實，獐牙菜苦苷(結構式：C16H22O10)具有抗肝纖維化、解痙、消炎、鎮痛等多種藥理活性作用[6-9]。本研究通過給予胃癌MGC803細胞及其移植瘤小鼠模型不同濃度的獐牙菜苦苷，旨在探討獐牙菜苦苷對MGC803細胞的體內外抑制作用。

材料與方法

一、細胞株、實驗動物、主要試劑

胃癌細胞株MGC803由上海中科院細胞庫提供。RPMI1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco公司。MTT、二甲基亞砜(DMSO)由美國Sigma-Aldrich公司提供。1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液購于碧云天生物技術有限公司。獐牙菜苦苷標準品純度>98%, 購自于上海諾辰生物技術有限公司。Bcl-2、Bax酶聯免疫吸附測定試劑盒購自上海悉墨生物科技有限公司。Ki-67一抗抗體購自美國Abcam公司。

24只雄性BALB/c裸鼠(SPF級)購于上海市腫瘤研究所，約8周齡，體質量(20±1) g，飼養于上海腫瘤研究所動物實驗中心，光暗周期12 h∶12 h，自由飲食、飲水。

二、方法

1. 細胞培養：胃癌MGC803細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，37 ℃、5% CO2培養。獐牙菜苦苷標準品以DMSO溶解備用，DMSO終濃度不超過0.1%。

2. MTT法檢測細胞活性：取對數生長期的MGC803細胞，加入適量胰蛋白酶消化，吹打制成單個細胞懸液，調整細胞密度為5×103/mL，以每孔200 μL接種于96孔培養板上。各孔分別加入不同濃度的獐牙菜苦苷(0、20、40、80、100 μg/mL)，每個濃度設6個復孔。分別培養12、24、48 h后，加入MTT 20 μL/孔，培養4 h。吸除孔內培養基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻后，上酶標儀測定570 nm波長處的吸光度(A)值，計算細胞生存率。細胞生存率(%)=用藥組A值/對照組A值×100%，采用中效直線回歸曲線計算細胞半數抑制濃度(IC50)。

3. Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡：取胃癌MGC803細胞，制成1×106/mL的細胞懸液，鋪設于24孔板，每組設3個復孔，待細胞長至60%～70%密度時，加入不同濃度的獐牙菜苦苷(0、30、60、90 μg/mL)。培養48 h后，胰酶消化細胞，以含血清的完全培養基終止消化，吹打成細胞懸液。具體步驟按照Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒說明書操作，采用BD-FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

4. ELISA法檢測Bax、Bcl-2含量：取不同濃度獐牙菜苦苷(0、30、60、90 μg/mL)處理48 h后的MGC803細胞凍融裂解，4 ℃ 4 378×g離心10 min，分離上清液并檢測蛋白濃度。參照試劑盒說明書，經包被、加樣、加抗體、底物液顯色后，酶標儀測定450 nm波長處的各孔A值，根據A值和標準品濃度建立標準曲線，根據標準曲線計算測試樣本的Bax和Bcl-2含量并計算Bax/Bcl-2比值。

5. MGC803細胞裸鼠移植瘤模型的建立和分組：取對數生長期MGC803細胞制備成細胞懸液，將200 μL細胞懸液經右側腹腔皮下注射于BALB/c裸鼠，建立裸鼠移植瘤模型。每三天用游標卡尺測量腫瘤的最長徑(a)和最短徑(b)，計算瘤體積，瘤體積(mm3)=1/2×a×b2。待瘤體積長至 100 mm3時，隨機將裸鼠分為對照組、獐牙菜苦苷組(40、60、80 mg/kg)，每組各6只。將獐牙菜苦苷溶解于5% DMSO/0.9% NaCl溶液中，每日尾靜脈注射一次，對照組給予同等劑量5% DMSO/0.9% NaCl溶液。記錄裸鼠開始和最終的體質量，平均瘤體積>1 000 mm3時，麻醉下頸椎脫離法處死裸鼠，取出移植瘤并稱重。計算抑瘤率，抑瘤率(%)=(1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

6. 免疫組化法檢測Ki-67表達：處死裸鼠后，取移植瘤組織，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚連續切片。加入Ki-67抗體(工作濃度1∶200)4 ℃冰箱過夜；加入二抗37 ℃下孵育2 h，DAB顯色，光鏡下觀察。

結果判定：細胞核呈棕黃色顆粒為細胞陽性，計算Ki-67陽性細胞數占所有細胞的比例。

三、統計學分析

結 果

一、體外實驗

1. 細胞生存率：MTT實驗表明，獐牙菜苦苷的IC50為(56.51±6.20) μg/mL。不同濃度、不同培養時間獐牙菜苦苷對MGC803細胞增殖均存在一定程度的抑制作用(表1)。

2. 細胞凋亡率：Annexin V-FITC/PI法檢測結果顯示，與0 μg/mL 獐牙菜苦苷組相比，30、60、90 μg/mL 獐牙菜苦苷組MGC803細胞凋亡率均明顯上升(19.03%±1.30%、41.78%±5.96%、57.34%±8.43%對6.82%±1.04%,P<0.05)(圖1)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。

3. Bax、Bcl-2含量：ELISA法檢測結果顯示，與0 μg/mL獐牙菜苦苷組相比，30、60、90 μg/mL獐牙菜苦苷組促凋亡因子Bax含量明顯升高(P<0.01)，而抑制細胞凋亡因子Bcl-2含量明顯降低(P<0.01)，Bax/Bcl-2比值升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)(表2)。說明獐牙菜苦苷可誘導胃癌MGC803細胞凋亡。

二、體內實驗

1. 抑瘤率：與對照組相比，不同濃度獐牙菜苦苷組(40、60、80 mg/kg)裸鼠的瘤重均明顯降低(P<0.001)，同時抑瘤率明顯升高(表3)。

表1 不同濃度獐牙菜苦苷組的細胞生存率比較

與同時間點0 μg/mL獐牙菜苦苷組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

組別Bax(pg/mL)Bcl-2(pg/mL)Bax/Bcl-2比值0 μg/mL302.48±30.59153.36±21.481.97±0.4630 μg/mL356.17±48.16117.27±19.423.04±0.6060 μg/mL436.81±56.7493.65±13.694.66±0.8990 μg/mL513.69±73.2076.28±14.346.73±1.27

與0 μg/mL獐牙菜苦苷組比較，*P<0.05，**P<0.001

表3 各組MGC803移植瘤重量

*與對照組比較，P<0.001

2. Ki-67表達：免疫組化結果證實，與對照組相比，40、60、80 mg/kg獐牙菜苦苷組Ki-67陽性表達率明顯降低(55.14%±5.77%、28.18%±5.73%、10.25%±2.06%對68.27%±8.69%，P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖2)。

討 論

獐牙菜苦苷是一種具有多種藥理活性的植物單體，目前研究多集中于代謝紊亂相關疾病的治療和預防，但尚缺乏其藥效分子機制、藥代動力學以及毒性方面的研究。在腫瘤研究領域，有學者初步證實了獐牙菜苦苷的體外抗腫瘤活性。趙李劍等[10]的研究顯示，50 μg/mL獐牙菜苦苷對肝癌細胞具有抑制、促凋亡作用。李潤琴等[11]亦證實，川東獐牙菜提取物可抑制HepG2人肝癌細胞生長并促進其凋亡，獐牙菜苦苷和芒果苷是其主要活性物質。但目前獐牙菜苦苷抑制腫瘤細胞的機制尚未完全清楚。

細胞凋亡是主要的抗腫瘤途徑。藥物阻滯腫瘤細胞生長往往是通過誘導細胞凋亡來實現的。本實驗采用經典的Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡情況，結果顯示不同濃度的獐牙菜苦苷均可誘導胃癌MGC803細胞的早期和晚期凋亡，且呈劑量依賴性，證實獐牙菜苦苷可誘導MGC803細胞凋亡。Bax/Bcl-2比值在細胞生理過程，特別是線粒體生理過程中起有重要作用[12]。Bax/Bcl-2比值升高可導致線粒體膜電位失衡，激活caspase-3等凋亡途徑，促進細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞生長[13]，但詳細機制有待進一步研究。本研究發現，獐牙菜苦苷可有效升高Bax/Bcl-2比值，從而誘導胃癌MGC803細胞凋亡，抑制細胞增殖。

圖1 各組細胞凋亡率的流式細胞圖(Annexin V-FITC/PI法)

圖2 各組Ki-67的表達情況(免疫組化染色，×200)

進一步的體內實驗發現，各組MGC803細胞移植瘤的裸鼠體質量無明顯差異，說明獐牙菜苦苷在裸鼠體內是一種安全的藥物。同時，不同濃度的獐牙菜苦苷給藥后，MGC803移植瘤體積均明顯縮小。說明獐牙菜苦苷可有效抑制MGC803胃癌細胞移植瘤的生長。Ki-67蛋白是一種與細胞增殖相關的核抗原，可反映腫瘤細胞的增殖活性[14]。本實驗中，隨著獐牙菜苦苷給藥濃度的增加，Ki-67蛋白水平逐漸下降并呈劑量依賴性，證實獐牙菜苦苷可抑制MGC803移植瘤的增殖。

綜上所述，本研究通過體外、體內實驗證實獐牙菜苦苷具有明顯的抗腫瘤活性，其作用機制可能是通過升高Bax/Bcl-2比值，從而引起腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖。獐牙菜苦苷作為一種自然界廣泛存在的植物單體，在多種植物中均可穩定獲得，為含獐牙菜苦苷的植物的綜合利用和藥理開發奠定基礎，如后期修飾結構、改善療效，有望成為一種新型的抗腫瘤藥物。但其作用機制仍需進一步深入研究。