清解扶正顆粒體外抑制血管新生的作用機制研究*

曹治云 余旋 魏麗慧 曾建偉 趙錦燕 黃彬 林久茂#

（1福建中醫藥大學中西醫結合研究院 福州350122；2福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室 福州350122）

腫瘤的發生發展與機體正氣不足、臟腑功能失調及熱毒積聚密切相關，多因氣滯、血瘀、痰凝、毒聚而形成[1]。中醫藥在腫瘤的治療中發揮著獨特的作用，已經證實有些中藥具有通過調控腫瘤血管生成從而達到抗腫瘤的功效。清解扶正顆粒（Qingjiefuzheng Granules，QFG）是臨床驗方，由白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽等組成，其中白花蛇舌草為君，具有清熱解毒、消癰散結、利尿除濕的功效；半枝蓮為臣，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛的作用，輔助君藥，增強清熱解毒之功效；黃芪為佐，具有補氣健脾、益衛固表、利尿消腫、生津的功效，調和君臣的寒涼之性；麥芽為使，具有行氣消食、健脾開胃、退乳消脹的功效，在增強君臣作用之時，調和脾胃運化，兼顧后天之本。清解扶正顆粒臨床輔助化療藥物治療多種惡性消化道腫瘤，具有改善患者的生活質量、減輕胃腸不良反應等作用。我們的實驗研究表明QFG對大腸細胞具有抑制增殖和誘導凋亡的作用[2]，但治療大腸癌等惡性腫瘤的作用機制尚不清楚。故本研究在前期研究的基礎上，探討了QFG對血管新生的調控作用，以期為QFG的臨床應用提供實驗依據。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 藥物與細胞株 清解扶正顆粒（QFG）由福建中醫藥大學藥學院制劑室提供，用磷酸鹽緩沖液（PBS）配成200 mg/ml儲存溶液，超聲30 min助溶，用0.45 μm過濾器過濾，再用培養基配成所需要的濃度。人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）購自中科院上海細胞庫。

1.2 試劑 RPMI 1640培養基、雙抗（青霉素-鏈霉素）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、0.25%胰蛋白酶、二甲亞砜（DMSO）均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍[3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]干粉購自北京索萊寶科技有限公司；PBS購自美國Hyclone公司；管腔形成試劑盒購于德國Merck Millipore公司，VEGF-A、VEGFR-2購于美國 Proteintech公司，MMP-2、MMP-9抗體購自中國BBI Life Sciences公司。

1.3 儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；二氧化碳培養箱、-80℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統（德國Leica儀器有限公司）；形態學顯微圖像分析系統LAS V4.1、Countes全自動細胞計數儀（美國Life公司）。

1.4 細胞培養 將HUVEC分別培養于含10%FBS、1%雙抗（含 100 U/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素）的RPMI 1640完全培養基中，并于37℃、5%CO2和飽和濕度的細胞培養箱中培養，待細胞單層貼壁生長至匯合度為80%～90%時，加入1 ml的胰蛋白酶消化1～3 min，隨后加入2 ml完全培養基終止消化，于離心機中以1 000 r/min的轉速離心3 min后，吸棄上清并收集沉淀細胞用于后續實驗。

1.5 MTT法檢測細胞增殖 收集HUVEC細胞，加入完全培養基，分別制備密度為1.0×105個/ml的細胞懸液，并按100 μl/孔的原則均勻地接種于96孔培養板中，培養于細胞培養箱中，當每孔細胞的匯合度達到50%～60%時，輕輕吸走原孔中培養基，隨后每孔分別加入100 μl不同濃度的QFG（終濃度分別為 0、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/ml，其中 0 mg/ml為對照組），干預24 h或48 h后再次吸走原孔中溶液，并加入等體積的MTT溶液（100 μl/孔，0.5 mg/ml），繼續培養4 h后吸棄各孔中的液體，每孔加入等體積DMSO并振蕩混勻，于酶標儀570 nm波長處測定各孔吸光度值（A值），計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率（%）=（1－實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.6 細胞形態觀察 收集HUVEC細胞，加入完全培養基，分別制備密度為2.0×105個/ml的細胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養于細胞培養箱，待每孔細胞匯合度達到50%～60%時，吸棄孔中原培養基，并重新加入等體積不同濃度的QFG（終濃度分別為 0、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/ml，其中0 mg/ml為對照組）干預24 h，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化并拍照記錄。

1.7 劃痕實驗 收集HUVEC細胞，加入完全培養基，分別制備密度為1.0×105個/ml的細胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養到鋪滿單層，用無菌槍頭在單層細胞上劃出一字痕，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入含有QFG的培養液后放入37℃、5%CO2的培養箱培養24 h，于6 h、18 h、24 h不同時間點測量并拍照。

1.8 管腔形成實驗 收集HUVEC細胞，加入完全培養基，分別制備密度為2.0×105個/ml的細胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養于細胞培養箱，待每孔細胞匯合度達到50%～60%時，吸棄孔中原培養基，并重新加入等體積不同濃度的QFG（分別為 0、0.25、0.5、0.75 mg/ml），干預 24 h后，將細胞收集并配制成2×105細胞懸液，以1∶1比例加入基質膠中孵育3 h后觀察成血管情況并拍照。

1.9 Western-blot檢測蛋白表達 總蛋白提取后，約50 μg總蛋白進行10%和12%的SDS-PAGE膠電泳，轉膜后與稀釋一抗（濃度是1∶1 000）4℃孵育過夜，切膜后緩沖液洗膜3次，每次10 min，室溫下搖床二抗孵育1 h，顯影并拍照。

1.10 統計學分析 實驗數據均用SPSS22.0統計學軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。計數資料用率表示，采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 QFG對HUVEC形態的影響 倒置顯微鏡觀察結果顯示HUVEC經不同濃度的QFG（0.25、0.5、0.75 mg/ml）干預 24 h 后，與對照組（0 mg/ml）比較，各濃度藥物均對HUVEC的形態和細胞密度無明顯影響。該結果表明濃度≤0.75 mg/ml的QFG對HUVEC的生長沒有影響。見圖1。

2.2 QFG對HUVEC活力的影響 MTT檢測結果顯示，HUVEC經不同濃度的QFG分別干預處理24 h和48 h后，HUVEC的活力受到不同程度的影響，當濃度≥0.75 mg/ml時，QFG對HUVEC活力具有明顯的抑制作用，這種作用具有一定的劑量依賴性，但無明顯的時間依賴性。見表1。

表1 QFG對HUVEC活力的影響（n＝8，±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

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2.3 QFG對HUVEC遷移的影響 劃痕實驗結果顯示QFG具有抑制HUVEC損傷修復能力的作用。劃痕損傷24 h后，對照組HUVEC的劃痕已經鋪滿細胞，而隨著QFG給藥濃度的不斷增大，給藥組HUVEC細胞劃痕中間的距離不斷增大，呈濃度依賴性。該結果證實QFG對HUVEC細胞遷移能力具有顯著的抑制作用。見圖2。

圖2 QFG對HUVEC遷移能力的影響（×100）

2.4 QFG對HUVEC成血管能力的影響 體外成血管實驗結果表明，與對照組比較，QFG處理后的HUVEC成血管能力隨著給藥劑量的增加而逐漸降低，表現出顯著的劑量依賴關系，表明QFG具有抑制血管新生的作用。見圖3。

圖3 QFG對HUVEC成血管能力的影響（×100）

2.5 QFG對HUVEC細胞中 VEGF-A、VEGFR-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響 蛋白表達檢測結果顯示，QFG對HUVEC細胞中VEGF-A、MMP-2、MMP-9蛋白表達具有顯著調控作用。與對照組比較，隨著給藥濃度增加，VEGF-A、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平逐漸降低，呈現顯著濃度依賴關系。見圖4。

圖4 QFG對HUVEC中VEGF-A、VEGFR-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

3 討論

實體腫瘤內部血管生成與促血管生長因子的分泌和表達直接相關。目前，研究得較多而又透徹的促血管生長因子是血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）。其中，VEGF-A在多種正常組織器官如肺、腎、心、卵巢等中均有表達，同時它也是促進腫瘤血管生長的主要因子。VEGF-A通過增加血管通透性，導致血漿蛋白外漏，大量纖維蛋白酶原聚集后形成臨時基質，使血管內皮細胞（Vascular Endothelial Cell，VEC）在血管外得以生存。VEC細胞的增殖和遷移是血管新生的核心，這與多種促血管生成因子有直接相關性，如VEGF-A、b-FGF、TGF-α、PDGF、IL-8 等[3～4]。本研究結果發現QFG具有抑制HUVEC細胞活力的作用，細胞形態學觀察進一步佐證QFG可誘導HUVEC凋亡，同時抑制HUVEC的遷移及體外成血管能力，初步證實了QFG具有抑制腫瘤血管新生的作用，這可能是QFG抗腫瘤作用的機制之一。

當VEGF-A、VEGFR-2與VEC表面整合素αⅤβ3黏合后促進VEC增殖，而后在激活基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinas，MMP）作用下，向胞外域遷移[5]。基質金屬蛋白酶對基底膜及壁細胞的降解起調控作用，MMPs會釋放一些胞外基質中缺乏的促血管生長因子，降解血管基底膜，促進內皮細胞遷移及腫瘤血管的生成。MMP-2和MMP-9是MMP家族中重要的2個因子，血管新生啟動過程的重要成員，可通過促進VEGF的釋放及其他血管形成因子的表達促進腫瘤血管的新生，上調腫瘤的血管化[6]。有多篇報道證實中藥通過調控MMPs及VEGF、VEGFR的作用抑制腫瘤血管生成，單體如大黃素、姜黃素、長春堿、喜樹堿、苦參堿、去甲斑蝥素、小檗堿、丹參酮、川芎嗪等[7～13]，復方如六神丸、薏苡仁注射液、參麥注射液、澤瀉飲、鱉甲煎丸等[14～18]。中藥抑制腫瘤血管新生的機制主要是通過抑制血管生成因子及其受體的表達如VEGF、b-FGF、VEGFR等，抑制基質金屬蛋白酶及其抑制物的表達如MMP、TIMP，抑制黏附及趨化因子的表達如ICAM、CXCR等，抑制血管新生相關信號轉導通路后降低微血管密度。本研究在明確QFG抑制腫瘤血管新生的作用后，進一步檢測其對促血管生成因子VEGF-A、VEGFR-2及基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達調控，實驗結果顯示，QFG 顯著抑制 VEGF-A、MMP-2、MMP-9 核心血管生成因子蛋白的表達。MMP-2和MMP-9是血管新生啟動過程的重要成員，活化的MMP-2定位于細胞穿透基質的突出部位，MMP-9是以酶原的形式從胞內分泌到胞外，在酶解細胞間基質成分及基底膜的主要成分中起重要作用[19]。綜上所述，QFG可能是通過影響血管生成核心因子的表達進而影響相關信號通路的調控，從而達到抑制腫瘤血管新生作用，相關結果還需進一步實驗驗證。