磷摻雜碳量子點的分離及其光學性能研究

雷 云， 黃丹丹， 林新華， 劉愛林

納米碳量子點是一種以碳元素為主體的、具有熒光發(fā)射功能的碳球[1]。碳量子點因粒徑差異可發(fā)射出不同顏色的熒光[2]，因此又稱為熒光碳量子點[3]。熒光碳量子點被近紅外光激發(fā)后，在近紅外光譜范圍內可顯示熒光，可應用于體內納米生物技術。與傳統(tǒng)的有機染料和半導體量子點相比，熒光碳量子點因具有低細胞毒性、高光穩(wěn)定性、良好的化學惰性和生物相容性等特點而被廣泛應用于生物成像和光催化中[4-5]。在合成碳量子點的大部分方法中，所得產物均存在尺寸、形貌不均一的現(xiàn)象，甚至還包含許多合成中間體及未反應的原料[6]，為獲得形貌均勻且尺寸分布窄的碳量子點就需要進行分離。因此，將產物分離純化，從而擴大其在熒光探針及生物傳感器中的應用具有重要的意義。熒光碳量子點的分離具有較大的可控性和靈活性，可以進行有目的地分離，既可依據(jù)碳量子點的尺寸，也可根據(jù)碳量子點的極性大小以及表面的電荷量進行分離，如聚丙烯酰胺凝膠電泳法、毛細管電泳法、陰離子交換離子色譜法、反相高效液相色譜法、離心分離法[7-14]。本研究基于熒光碳量子點的極性大小，利用硅膠柱層析色譜對制備的磷摻雜碳量子點混合物進行分離，并對各組分的光學性能進行研究，為進一步獲取高質量的熒光碳量子點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 膦甲酸鈉(≥98%，上海阿達瑪斯公司)；果糖(≥98.5%，美國GENVIEW公司)；硫酸奎寧(99.0%，上海阿拉丁公司)；乙酸乙酯及甲醇(上海泰坦科技股份有限公司)；濃硫酸(98%)及硅膠(200-300目)(上海國藥集團化學試劑有限公司)。上述試劑如無特別說明，均為分析純。

聚四氟高壓反應釜(YZ-HR-25ML，北京巖征生物科技有限公司)；紫外可見分光光度計(UV-2450型，日本島津公司)；熒光分光光度計(F-4600型，日本日立公司)；紅外光譜儀(Nicolet 380，上海馭锘實業(yè)有限公司)；電子分析天平(BS110S，德國Sartorius公司)；臺式高速冷凍離心機(Neofuge 23R，上海力新儀器有限公司)；鼓風干燥箱(BAO-80A，施都凱設備有限公司)；冷凍干燥器(FD-1-50，天津比朗實驗儀器制造有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀(RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠)。

1.2方法

1.2.1磷摻雜碳量子點的制備 稱取果糖1.8 g和膦甲酸鈉1.1 g，加入10 mL去離子水，待樣品完全溶解后，轉移至聚四氟高壓反應釜內，密封。置于烘箱內，于200 ℃下反應3 h后，關閉電源，自然冷卻至室溫。將反應結束的樣品溶液轉移至15 mL離心管，繼續(xù)向反應釜內加入5 mL去離子水，充分攪拌沉淀后一并轉移至離心管內，12 000 r/min離心10 min。取上清液，用0.22 μm的濾膜過濾，即得碳量子點溶液。將所得的碳量子點溶液冷凍干燥后用去離子水復溶成一定濃度的碳量子點溶液。

1.2.2磷摻雜碳量子點的分離 稱取硅膠35.0 g于潔凈的瓷盤上，并置于烘箱中活化，100 ℃恒溫加熱45 min，待活化完畢，降至室溫取出。采用濕法裝柱，以不同體積比的乙酸乙酯-甲醇溶液為洗脫劑，依次進行洗脫(溶劑比例依次為100∶0，80∶20，50∶50，20∶80，0∶100)，在洗脫過程中逐漸增加洗脫溶劑的極性，直至樣品被全部洗脫。每個淋洗梯度依次收集12管洗脫液，每管體積約9 mL，共計收集60管，并按照流出順序編號為1～60。收集的洗脫液分別轉移至圓底燒瓶中，通過旋轉蒸發(fā)濃縮至1～2 mL，并真空干燥得到熒光碳量子點固體產物，加入一定去離子水，配制成一定濃度的熒光碳量子點溶液。

2 結 果

2.1硅膠柱色譜分離條件的優(yōu)化 實驗采用乙酸乙酯-乙醇、乙醇-水、乙酸乙酯-甲醇3種不同的洗脫體系分離碳量子點。以乙酸乙酯-乙醇為洗脫體系，發(fā)現(xiàn)乙醇比例增大至50%時，樣品才開始被洗脫。該洗脫體系流速慢，樣品色帶遷移速度緩慢，洗脫時間長，且乙醇比例增大至100%時，仍有部分樣品未被洗脫。因此，改用洗脫能力大的乙醇-水為洗脫體系，當乙醇和水比例為100∶0時，碳量子點樣品被大量洗脫；當二者比例為80∶20時，觀察到兩條明顯色帶；當二者比例為70∶30時，樣品層幾乎被全部洗脫，不利于樣品收集制備。因此，改乙酸乙酯-甲醇體系作為洗脫體系，分別以100∶0，80∶20，50∶50，20∶80，0∶100的比例梯度依次淋洗硅膠柱。當乙酸乙酯含量為100%時，樣品開始被洗脫；隨著洗脫溶劑極性增大，硅膠柱陸續(xù)出現(xiàn)多條顏色深淺不同的色帶；當比例為20∶80時，柱色譜中大量碳量子點樣品被洗脫；當比例為0∶100時，樣品層幾乎被全部洗脫，收集流出液，測試每個組分的光學性能。

2.2不同洗脫條件下碳量子點熒光性能的考察 分別測定不同洗脫條件下分離獲得的碳量子點組分的激發(fā)光譜和熒光光譜，不同洗脫組分的發(fā)光性質(包括激發(fā)波長和發(fā)射波長)見表1。可見相同洗脫條件下獲得的組分的激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長較為相近，如1～13號的激發(fā)波長為225～234 nm，發(fā)射波長為380～400 nm。同時依據(jù)相近的發(fā)光性質，將碳量子點組分分成三類(表1)。隨著甲醇的比例增大至50%之后(組分編號32～60)，收集組分激發(fā)峰和發(fā)射峰基本未發(fā)生位移，且與未分離的碳量子點混合液的激發(fā)峰和發(fā)射峰位置一致(圖1)，該部分碳量子點約占所收集溶液的一半。

2.3碳量子點的紫外光譜和熒光光譜表征 根據(jù)發(fā)光性質選取典型組分(編號分別為10，24，37，極性依次增大)進行光譜表征。3個組分與摻磷碳量子點混合液的紫外-可見吸收光譜圖見圖2A，可見在240～260 nm均有吸收峰。不同組分熒光碳量子點的歸一化熒光光譜圖見圖2B，其中插圖為未分離的碳量子點與3個組分在365 nm波長的紫外燈下的光學圖片，未分離的碳量子點原液呈現(xiàn)微弱的淡藍色熒光，經分離得到的3個熒光碳量子點發(fā)射波長分別為400，432，453 nm，在紫外燈下分別呈現(xiàn)藍色、黃色、黃綠色熒光。

表1不同洗脫組分的激發(fā)波長和發(fā)射波長

Tab1The maximum excitation and emission wavelengths of the different carbon quantum dots

光學參數(shù)組分編號1～1314～3132～60λex (nm)225～234321～330349～358λem (nm)380～400421～433450～461

λex：激發(fā)波長；λem：發(fā)射波長.

λex：激發(fā)波長；λem：發(fā)射波長.圖1 未分離純化的熒光碳量子點混合液激發(fā)光譜和發(fā)射光譜Fig 1 The excitation and emission spectra of original carbon quantum dots

2.4碳量子點的紅外光譜表征 3個典型組分(編號分別為10，24，37)的紅外光譜圖見圖2C。可見3個組分的紅外光譜相似，具有相同的紅外特征峰，均出現(xiàn)了3 550,1 740,1 151和1 080 cm-1處的特征吸收峰。

2.5熒光量子產率的計算 熒光量子產率的測定方法參照文獻[15]，用五點法測定組分10,24和37及摻磷碳量子點混合液的熒光量子產率。以硫酸奎寧為參比物質，測量碳量子點和硫酸奎寧的稀溶液在碳量子點最佳激發(fā)波長下的積分熒光強度和吸光度值(應小于0.1),計算熒光量子產率，公式為：

ΦX=ΦST×(GradX/GradST)×(ηX2/ηST2)

其中，ФX為待測物質的熒光量子產率，ФST為已知參比物質的熒光量子產率；GradX和GradST分別表示以待測物質和參比物質的積分熒光強度與吸光度作圖工作曲線的斜率；ηX和ηST分別表示待測物質和參比物質的折光系數(shù)。0.1 mol/L 硫酸奎寧的熒光量子率為54%，0.1 mol/L 硫酸水溶液和碳量子點水溶液的折光系數(shù)相同，均為1.33。通過計算，發(fā)現(xiàn)硅膠柱層析法分離得到的組分10，24和37的熒光量子產率不同，分別為4.1%，5.2%和7.3%，未分離的碳量子點混合液的熒光量子產率為4.6%。

A：紫外-可見吸收光譜； B：熒光光譜(插圖為其在365 nm紫外燈下的光學圖); C:紅外光譜圖.圖2 不同碳量子點的紫外光譜、熒光光譜表征及紅外光譜圖Fig 2 The UV-Vis absorption spectra， the fluorescence spectra and FTIR spectra of the different carbon quantum dots

3 討 論

碳量子點的分離具有較大的可控性和靈活性，可對碳量子點進行有目的地分離，比如根據(jù)碳量子點的不同尺寸或者不同性質分別采用不同原理的方法將其分離，在分離過程中還能去除反應過程中的原料以及副產物，以實現(xiàn)對碳量子點進一步純化的目的。色譜法利用不同物質在不同相態(tài)的選擇性分配，用流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物中不同的物質會以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。本實驗以吸附色譜法中應用最為廣泛的硅膠為固體吸附劑，將混合物中各組分吸附到吸附劑上，用適當溶劑進行洗脫，利用不同極性的組分在硅膠表面吸附力不同，從而實現(xiàn)分離。吸附能力較弱的組分遷移速度快，先被洗脫；吸附能力較強的組分遷移速度慢，后被洗脫。在硅膠柱層析中，洗脫溶劑的恰當選擇對改善分離效果也產生重要的影響，洗脫能力主要由其極性決定。對于復雜混合物的分離，可采用二元混合溶劑體系來提高分離的選擇性。考慮到以果糖和膦甲酸鈉水熱法合成的磷摻雜碳量子點表面帶有極性官能團，所選溶劑應對樣品具有一定溶解性。因此，首先以乙酸乙酯這種中等極性溶劑為洗脫體系的主體，以乙醇極性溶劑為改性劑，考察該洗脫體系的分離效果，結果表明乙酸乙酯-乙醇洗脫體系對于碳量子點的洗脫強度太弱，同時由于乙醇的黏度大，降低了組分在兩相間的傳質速度，并削弱了柱子的滲透性，導致柱效下降，色譜條帶不清晰，碳量子點樣品也未被完全洗脫。然后選用乙醇-水洗脫體系，當改性劑水的含量稍微增加，即可使所有樣品都被洗脫，說明乙醇-水洗脫體系的洗脫能力太強，組分間無法實現(xiàn)有效分離。最后考察乙酸乙酯-甲醇洗脫體系，洗脫過程中采用極性不斷增加的梯度洗脫方式，通過調整乙酸乙酯和甲醇的體積比來改變洗脫劑的極性，使碳量子點合成產物中的各個組分逐漸分開，獲得較為理想的分離效果。

實驗采用硅膠柱層析技術，以乙酸乙酯-甲醇為洗脫體系分離純化磷摻雜碳量子點，收集60個組分，通過考察組分的熒光性能，發(fā)現(xiàn)不同極性洗脫條件得到的組分間的激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長存在較大差異，且隨著洗脫劑極性的逐漸增大，洗脫得到的碳量子點的激發(fā)波長和發(fā)射波長不斷紅移，且斯托克位移均>90 nm，可有效避免激發(fā)峰與發(fā)射峰的重疊，有利于碳量子點在熒光分析檢測方面的應用。

本研究選取3個典型組分進行紫外光譜表征，不同極性的組分間吸收峰位置略有差異，吸收曲線的形狀與摻磷碳量子點混合液也存在明顯不同。從熒光光譜中可觀察到組分的極性增大，其發(fā)射波長往長波方向移動，熒光強度也隨之出現(xiàn)增加趨勢，說明水熱法合成的碳量子點產物通過硅膠柱層析分離出的不同極性的碳量子點具有不同的光學性能。

采用紅外光譜對3個組分進行表征，結果表明，3個組分具有相同的紅外特征峰，其中3 550 cm-1處代表-OH特征吸收，1 740 cm-1處歸屬于羧基的C=O的伸縮振動，1 151 cm-1和1 080 cm-1分別歸屬于與膦甲酸鈉結構相關的特征官能團P=O和P-O-R。組分10和組分24的3 550 cm-1和1 740 cm-1特征峰尖銳并離散，組分37在這兩處特征峰則寬而集中，說明隨著洗脫劑極性的增強，所得組分表面的-COOH增多，碳量子點的極性增加。

熒光量子產率又稱為熒光效率，是熒光物質的重要發(fā)光參數(shù)。因此，本研究還測定了分離得到組分的熒光量子產率，結果表明碳量子點極性增大，發(fā)射波長發(fā)生紅移，熒光量子產率也隨之增強，出現(xiàn)分離后組分的熒光量子產率比未分離的碳量子點混合液的熒光量子產率大的現(xiàn)象，這可能是由于混合物中的碳量子點之間發(fā)生了能量共振轉移，說明硅膠層析柱可根據(jù)極性不同實現(xiàn)碳量子點組分的初步分離。

本實驗以果糖和膦甲酸鈉為前驅體合成磷摻雜碳量子點，并利用硅膠柱層析色譜對碳量子點混合物進行分離純化。經過優(yōu)化洗脫條件，選用乙酸乙酯-甲醇洗脫體系對碳量子點進行分離。對不同洗脫條件下得到的碳量子點樣品進行紫外-可見光譜、熒光光譜和紅外光譜表征以及熒光量子產率的測定。分離后的碳量子點組分具有未分離的碳量子點混合液不同的光學性能，隨著碳量子點極性的增大，組分的發(fā)射波長逐漸紅移。說明硅膠柱層析可有效分離碳量子點，后續(xù)處理步驟簡單，組分損耗小，成本低，可實現(xiàn)碳量子點的批量分離純化，為獲得高質量的熒光碳量子點提供可能性，有利于其在熒光分析和生物成像等領域中的應用。