6株拮抗細菌對哈密瓜細菌性果斑病的大田防效

武 芳，李 勇，路兆軍，王 敏，盛玉婷

（1.煙臺地元生物科技有限公司，山東 煙臺264000；2.海陽市農業技術推廣中心，山東 海陽 265100；3.煙臺市林業科學研究所，山東 煙臺264000；4.魯東大學 農學院，山東 煙臺 264000）

哈密瓜細菌性果斑病是由革蘭氏陰性細菌燕麥嗜酸菌西瓜亞種 (Acidovorax avenaesubsp. citrulli)引起的一種毀滅性病害，并且也是一種危險性檢疫病害，該病最早于1969年由Crall和Schenck在美國佛羅里達州發現，之后成為全世界的西瓜種子、幼苗和果實的一種嚴重威脅，被侵染的種子是重要的初侵染源，可造成西瓜細菌性果斑病的大面積暴發。且近些年來，其他瓜類作物，如哈密瓜、黃瓜、南瓜和西葫蘆等瓜類作物上也檢測到了該病害的發生。

內蒙古巴彥淖爾市從1991年開始從新疆引種種植哈密瓜，種植面積高達13.3萬hm2，每年種植的品種有40～50個。因為其廣泛的種植面積，為細菌性果斑病的發生提供了基礎，在20世紀末開始發生該病害，每年生產田發病率45%～100%，經濟損失嚴重，并有上升趨勢，已成為哈密瓜產業發展的首要障礙，所以，防治該病害的發生成為一種亟待解決的問題。

隨著社會的發展，經濟水平的提高，人們越來越關注食品安全，傳統的化學農藥因為其污染環境并且高殘留的特點，逐漸成為人們排斥的對象，而環境友好型的生物農藥才是發展的趨勢。本試驗旨在研究拮抗菌株對哈密瓜細菌性果斑病的防治效果，從中篩選得到對該病有較好生防作用的菌株，為生產實踐奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗植物

本試驗所選品種為金蜜十號，由新疆寶豐種業有限公司研制，該品種屬中早熟哈密瓜品種，全生育期85 d左右，植物生長勢中等，果實橢圓形，金黃色底上覆有墨綠色斑點，中粗網紋布滿全瓜，桔紅肉，肉質較脆、蜜甜，風味佳，綜合抗性好，較耐霜霉病、抗白粉病，易感細菌性果斑病，種植區域廣泛。

1.2 試驗藥劑

72%的農用鏈霉素，由華北制藥股份有限公司生產；王酮·代森鋅，由保加利亞艾格利亞有限公司生產。

1.3 供試生防菌株和培養基

生防菌株如表1中所示，菌株均來源于本公司實驗室細菌菌株庫。培養基：LB培養基（由南京基天生物技術有限責任公司生產）。

表1 供試拮抗菌菌株

1.4 6株生防菌株培養方法及菌液的制備

培養方法：于-70 ℃冰箱中取出原始菌株，在LB平板上劃線，28 ℃下培養24 h，待長出單菌落，挑取其接入含有5 mL LB 培養液的試管中，28 ℃、200 r/min培養24 h，制成種子液；以1%的接種量將種子液接種于裝有500 mL LB 培養液的1 L規格的大三角瓶里，28 ℃、200 r/min培養22～24 h。待菌液制備好之后，6 000 r/min離心30 min，棄上清液，用無菌水將沉淀重懸浮，終濃度調試為1×108cfu/mL備用。

1.5 6株拮抗細菌對哈密瓜苗期的促生試驗

本試驗共設置8個處理，分別為1：生防菌DY54；2：生防菌DY03；3：生防菌DY13；4：生防菌DY02；5：生防菌DY21；6：生防菌DY20；7：王酮·代森鋅；8：清水對照。每個處理4次重復，每個小區20 m2（約種植26棵瓜苗），采用隨機區組排列，各小區間設置適當寬度的隔離行。在種子播種之前，首先用為72%的農用鏈霉素進行消毒處理10 min，晾干后播種。待瓜苗長到2片真葉時，用1×108cfu/mL生防菌液進行處理。采用灌根和噴霧同時處理的方法，即在瓜苗2片真葉時，在瓜苗根圍緩緩灌入20 mL的生防菌液同時將生防菌液噴施到葉片的正反兩面，每隔15 d處理一次，在種植后35 d時統計其促生效果，按照5點取樣法，對瓜苗的莖粗、莖長和葉片數進行統計。

1.6 6株拮抗細菌對哈密瓜細菌性果斑病的防效試驗

菌液處理方法同上，待哈密瓜開始發病后，統計其病害，病害分級共有0、1、2、3、4、5、6共7個等級，分級標準如下：

0級：不發病；

1級：病葉上有零星病斑，病斑占葉面積的10%以下；

2極：病葉上有少量病斑，病斑占葉面積的11%～25%；

3級：病葉上病斑數量中等，病斑占葉面積的26%～50%；

4級：病葉上病斑數量較多，病斑占葉面積的51%～75%；

5級：病葉上有許多病斑，病斑占葉面積的76%～90%；6級：病葉上有大量病斑，病斑占葉面積90%以上；病害嚴重度=[Σ (病級葉片數×代表級數)／葉片總數×最高代表級值]×100%；

防效=(對照發病率－處理發病率)／對照發病率×100%。

1.7 6株拮抗菌株對哈密瓜果實產量的影響

在果實成熟后，對每個小區的哈密瓜果實產量進行統計，并計算其產量增加量。

產量增加量=（處理組果實質量-對照組果實質量）/對照組果實質量×100%。

1.8 6株拮抗菌株對哈密瓜果實品質的影響

哈密瓜果實成熟后，在每個小區按照五點取樣法選取5顆果實，即每個處理共選擇20顆果實進行品質檢測，其中哈密瓜的可溶性糖、可溶性蛋白質、維生素C含量測定參照《植物生理生化實驗原理和技術》中提供的方法，其可溶性固形物含量用手持測糖儀（WXY2I型）進行檢測，果肉硬度用果實硬度計（GY-B型）測定。

1.9 大田試驗中病原菌的鑒定

在田間采集哈密瓜病害葉片，采用平板劃線分離法進行分離。取病健交界處的組織4～5 mm，先在75%的酒精里浸泡10 s，再用0.001%的升汞中消毒2～3 min，后用無菌水漂洗3次，然后將組織碾碎到1～2 mL的無菌水中，梯度稀釋，用接種環蘸取菌懸液在LB平板上劃線，在28 ℃條件下培養24 h，挑取單菌落到含有5 mL LB培養液的試管中，28 ℃、200 r/min培養22～24 h。

用上海賽百盛基因技術有限公司的基因組DNA快速提取試劑盒，提取細菌的基因組DNA，以提取的DNA產物為模板，用細菌16S rDNA擴增通用引物U8-27 [5′-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3′]、L1494-1514 [5′-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3′]從 基 因 組 DNA 中 擴增出16S rDNA基因片段，將片段產物克隆到pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α后，挑取陽性單克隆，培養，送到測序公司測序，并BLAST比對。

2 結果與分析

2.1 6株拮抗細菌對哈密瓜苗期的促生結果

在哈密瓜種植35 d后對其莖粗、莖長和葉片數進行統計，結果表明，各處理組中哈密瓜的莖粗、莖長和葉片數較清水對照組均有不同程度的增加，而與藥劑組相比，只有DY54、DY03和DY20 3個處理組中哈密瓜的莖粗、莖長和葉片數有所增加（表2）。

表2 6株拮抗細菌對哈密瓜苗期的促生結果

2.2 6株拮抗細菌對哈密瓜細菌性果斑病的防效結果

在哈密瓜種植60 d后，細菌性果斑病發病達到高峰，對其發病指數和發病率進行統計、計算，結果表明，各處理組的病害嚴重度和發病率均低于清水對照組，并且處理組DY54、DY03的病害嚴重度和發病率也低于藥劑組（表3、圖1）。根據對其整個發病期的發病指數的統計結果進行計算（圖2），發現拮抗細菌DY54和DY03能夠延遲病害的發生，拮抗細菌DY54可延遲4 d，DY03可使病害延遲2 d；8月初是該病害迅速發生的時期，應采取更進一步的防治措施來控制該病害的傳播。

表3 6株拮抗細菌對哈密瓜細菌性果斑病的防效結果

表4 6株拮抗細菌對哈密瓜果實產量的影響

圖1 6株拮抗細菌對哈密瓜細菌性果斑病的防效

圖2 6株拮抗細菌處理組病害嚴重度趨勢

2.3 6株拮抗菌株對哈密瓜果實產量的影響

在哈密瓜果實采收時，對果實進行稱質量，經統計計算，各處理組對果實的產量也有一定的促生作用，并且相對于化學對照組，除處理組DY21以外，其他能使哈密瓜的果實產量增加(表4)。

2.4 6株拮抗菌株對哈密瓜果實品質的影響

哈密瓜果實成熟后，對其可溶性糖、可溶性蛋白、維生素C、可溶性固形物含量和果肉硬度等指標進行檢測，結果表明，各處理組也可在一定程度上改善果實的品質，尤其在可溶性固形物含量這一指標上表現明顯，并且相對于藥劑組，拮抗細菌DY54和DY03能夠提高果實品質的所有指標 (表 5)。

2.5 病原菌的鑒定結果

在病害發生的同時，對其病葉進行采集，經分離鑒定，有約1 500 bp大小的16S roNA片段，經測序、比對，與登錄號為NR 041758.1的菌株Acidovorax citrullistrain ICMP 7500 相似度達到99%。由此確定，田間發生的病害為由燕麥嗜酸菌(Acidovorax avenaesubsp.citrulli)引起的細菌性果斑病。

表4 6株拮抗細菌對哈密瓜果實品質的影響

圖3 病原菌的16SrRNA擴增結果

3 結論與討論

自細菌性果斑病發現以來，因為其危害重、傳播快，對瓜類生產造成了嚴重損失，成為人們研究的熱點，但一直以來都沒有找到有效的防治措施。生物防治作為一種新興的防治手段，成為人們的希望所在。但是在此方面研究相對還比較少，大多局限在平板拮抗或試驗條件易控制的溫室防效階段，Fessehaie和walcott采用Pseudomonas fluorescens(A506)、非致病菌A.avenaesubsp.avenae(AAA99-2)和從瓜種上獲得的1株未鑒定的革蘭氏陰性細菌WS-1在西瓜花期進行接種，經試驗，結果表明P. fluorescens(A506)和A. avenaesubsp.avenae(AAA99-2)具有很好的生防效果，并且能有效阻止細菌性果斑病菌侵染種子，同時還發現A.avenaesubsp.avenae(AAA99-2)這一菌株可以提高種子的發芽率，所以認為其具有良好的發展前景。泰國和巴西也相繼報道了用生防菌來抑制細菌性果斑病菌的發展，他們利用Bacillus mageteriumpv.cerealisRAB7、Streptomyces-84和-87進行平板拮抗測定，表現出了良好的抑菌效果，但并沒有深入的做下去。前人報道了用酵母菌來防治細菌性果斑病，取得了良好的效果，但是其并沒有進行大田試驗，不能充分說明該菌的生防效果及穩定性。

以上研究結果表明，試驗中所選用的幾株拮抗菌株對細菌性果斑病的防治均有一定的效果，本研究所選用的拮抗菌株大多是芽孢桿菌，這可能是因為芽孢桿菌為土壤和植物微生態優勢種群，有極強的抗逆性，被認為是一類理想的生防菌。前人用芽孢桿菌BB11、FH17來防治辣椒疫病，達到了55.8%和37.1%的防效；用芽孢桿菌防治番茄青枯病，取得了高達90.18%的防效。這些都說明芽孢桿菌是一類極具生防潛力的菌株，可能是由于芽孢桿菌能夠誘導植株產生系統抗性所致。另外一株拮抗菌株黏質沙雷氏也表現出了一定的生防效果，由沙雷氏菌防治番茄青枯病的研究一致。但是拮抗作用究竟在以什么樣的方式起作用，還有待進一步研究。