多效唑和三碘苯甲酸對大葉黃楊根系和葉片氮積累的影響

韓叢蔚，徐程揚

（國家重點森林培育和植物保護實驗室/半干旱與干旱重點實驗室/北京林業大學，北京 100083）

氮既是植物生長的基本限制性因子，又是最重要的營養元素之一，它的有效利用可以增加植物的適應性。氮在植物體內通過根系的吸收、莖的運輸，最終在葉片中同化，合成蛋白質和葉綠素等重要物質，為光合作用提供物質基礎[1-2]，其中根是氮吸收的主要器管，葉片則作為氮匯成為含氮化合物的合成、分配場所[3]，因此研究根系和葉片的氮代謝變化原因具有重要意義。

綠籬植物和幾何造型樹木是城市園林綠化的重要成分，然而頻繁的修剪極大提高了其管理成本，為降低成本，國內外學者在使用多效唑 (PP333)[4-6]、三碘苯甲酸 (TIBA)[7-8]等生長調節劑進行化學修剪方面開展了大量研究，并形成一些生產應用的產品[9]。PP333主要通過抑制赤霉素的生物合成從而降低樹木枝條生長[10-11]，TIBA則通過抑制生長素極性運輸起到延緩生長的作用[12]。目前，國內外學者關于植物生長延緩劑對礦物質養分元素在果樹葉片中的積累[13-14]、根系吸收形態性狀[15-16]的影響及其分子學機理[17-18]等方面進行了研究，但關于PP333和TIBA對氮在綠蘺植物體內分配機理方面的研究鮮見報道。

大葉黃楊 (Buxus megistophyllaLevl.)，別名黃楊木，是溫帶及亞熱帶樹種，廣泛栽培于我國中部及北部各省，由于其樹形優美、可飾性強而具有極高的園林觀賞價值，是城市中最常見的綠蘺植物之一。本試驗以三年生大葉黃楊苗木為試驗材料，采用雙因素隨機區組設計，研究PP333和TIBA對根系以及葉片內氮及其他形態氮物質含量分配規律的影響，以揭示大葉黃楊的氮分配對植物生長延緩劑的響應機理，旨在為綠蘺植物的化學修剪篩選合適藥品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗地設在北京林業大學妙峰山實驗林場的普昭院苗圃地 (39°54′N、116°28′E)，位于北京市海淀區西北郊北安河鄉境內，屬典型的暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，年平均日照時數為2769 h，植物生長期222 d，無霜期180 d[19]。

2015年7月，將一年生大葉黃楊扦插苗栽植到苗圃地內。試驗區為480 m2(24 m × 20 m)，幼苗按2 m ×2 m株行距栽植，試驗區周圍設置保護行，采用常規水肥管理。兩年后選用健康且長勢一致的大葉黃楊苗木作為試驗材料。

1.2 試驗設計

本試驗采用兩因素完全隨機區組設計。因素A為多效唑(PP333)，設置包含空白對照的四個濃度水平：0(P1)、20 mg/L(P2)、50 mg/L(P3) 和 80 mg/L(P4)。因素B為三碘苯甲酸(TIBA)，設置包含空白對照的三個濃度水平：0(T1)、50 mg/L(T2) 和100 mg/L(T3)。自2017年4月5日起，每隔25 d對苗木進行不同濃度水平的PP333和TIBA兩兩配合噴施，每個試驗小區噴施1 L溶液，至葉面兩側滴水為止，噴施時間選在晴天傍晚。試驗共設12個處理(表1)，3次重復，每個小區20株苗木，共計36個小區、720株苗木。

1.3 取樣及指標測定

2017年6月20日 (即第三次噴施25 d后) 進行全株取樣，在每個小區選取苗高、地徑接近該小區平均值的苗木6株，共取樣216株，保持根系完整，置于冷藏箱中運回實驗室。

將苗木沖洗干凈后，根系與地上部分分開，并利用游標卡尺將根系按徑級分為細根G1(D ≤ 2 mm)、中根 G2(2 ＜ D ＜ 5 mm) 和粗根 G3(D ≥ 5 mm)。取每個處理每個重復的3株合并，利用液氮與球磨儀粉碎根系、葉片，將磨好的鮮樣裝入離心管中放于超低溫冰箱保存 (-80℃)。測定硝態氮含量采用硝基水楊酸比色法，游離氨基酸含量采用茚三酮比色法；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法；光合色素含量測定采用紫外分光光度法 (UV-2600分光光度計，日本島津公司)。取每處理每個重復的另外三株合并后，分別將根系、葉片在105℃下殺青、80℃烘干至恒重，粉碎、過0.5 mm篩，樣品經H2SO4-H2O2消煮后，采用凱氏定氮法 (UDK-152，美國VelpScientifica公司) 測定全氮含量。

表1 各處理中PP333和TIBA濃度及處理代碼Table 1 PP333 and TIBA concentration in each treatment and the treatment codes

1.4 數據處理

采用SPSS22.0(美國IBM公司) 進行雙因素方差分析，研究不同濃度PP333、TIBA及其交互效應對根系氮吸收和葉片氮分配的影響。當存在交互效應時，研究不同處理組合對該指標的影響，并用Tukey HSD(α = 0.05) 作為多重比較方法。若不存在交互效應，因素間差異性采用F檢驗 (α = 0.05) 結果表示。測定指標時將同一重復的6株苗木首先進行合并，因此以重復為單位進行分析，即n= 3。

2 結果與分析

2.1 PP333和TIBA對大葉黃楊根系氮吸收的影響

從PP333、TIBA對各徑級根系全氮、游離氨基酸和硝態氮含量的F檢驗結果可知，施用PP333、TIBA以及同時施用PP333和TIBA使大葉黃楊G1徑級根系總氮含量、游離氨基酸、硝態氮含量均發生了顯著 (P＜ 0.05) 或極顯著變化 (P＜ 0.01) (表2)，PP333還使G2徑級根系總氮濃度、游離氨基酸、硝態氮含量發生顯著變化 (P＜ 0.05)。

PP333對G2徑級全氮含量、硝態氮含量、游離氨基酸含量有促進作用，但僅在PP333 80 mg/L梯度達到顯著水平 (P＜ 0.05)，分別較PP333對照顯著提高了32.90%、86.7%和49.52% (表3)。

表2 PP333、TIBA及二者交互效應對大葉黃楊根系含氮化合物影響的方差分析Table 2 ANOVA analysis on the effects of PP333, TIBA and their interaction on nitrogen-containing compounds in seedlings root of B. megistophylla

表4表明，各處理組合對G1徑級根系氮吸收均有不同程度顯著的促進作用 (P＜ 0.05)，其中，P3T3、P4T2和P4T3處理下的細根根全氮含量分別是空白組合的1.98、2.03、2.07倍，P3T2、P3T3、P4T2和P4T3使細根硝態氮含量提高了23.06%、22.71%、23.53%、23.14%，P3T2、P4T1、P4T2和P4T3處理下的細根游離氨基酸含量分別是空白組合的7.97、6.10、6.56和6.23倍。

表3 PP333的主效應對大葉黃楊根系含氮化合物的影響Table 3 Main effect of PP333 on nitrogen-containing compounds in seedlings root of B. megistophylla

表4 PP333和TIBA的交互效應對大葉黃楊根系含氮化合物的影響Table 4 Interactive effect of PP333 and TIBA on nitrogen-containing compounds in seedlings root of B. megistophylla

2.2 PP333和TIBA對葉片氮分配的影響

2.2.1 PP333和TIBA對全氮、可溶性蛋白、硝態氮和游離氨基酸含量的影響 施用PP333引起大葉黃楊葉片全氮含量、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量和硝態氮含量均發生極顯著變化 (P＜ 0.01)(表5)；而施用TIBA僅引起全氮含量和可溶性蛋白含量發生極顯著變化 (P＜ 0.01)。同時施用PP333和TIBA同樣引起葉片的全氮含量和可溶性蛋白含量發生極顯著變化 (P＜ 0.01)，且PP333對葉片各個含氮化合物指標的影響均大于TIBA。

PP333僅在80 mg/L對葉片硝態氮含量有顯著促進作用 (P＜ 0.05)，較對照處理提高了10.71%；在PP333 50、80 mg/L梯度對游離氨基酸有顯著促進作用 (P＜ 0.05)，較對照處理分別提高了31.05%和46.30%(表6)。

除P1T1、P1T2、P1T3和P2T1處理外，其余處理組合對葉片全氮和可溶性蛋白含量均有顯著的促進作用 (P＜ 0.05)，其中P4T3處理的全氮和可溶性蛋白含量分別是空白組合的1.80倍和2.28倍 (表7)。

2.2.2 PP333和TIBA對光合色素含量的影響 氮在植物葉片的代謝過程中，通常有超過半數的氮會分配到葉綠體中參與光合作用，光合色素含量決定光合作用的強弱。施用PP333、TIBA均引起葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量和類胡蘿卜素含量發生極顯著變化 (P＜ 0.01)，同時施用PP333和TIBA引起葉綠素a、葉綠素總量和類胡蘿卜素含量發生極顯著變化(P＜ 0.01)，葉綠素 b 含量發生顯著變化 (P＜ 0.05)，且PP333對各光合色素含量指標的影響均大于TIBA(表8)。

12個處理組合中僅P4T2和P4T3顯著提高了葉綠素a和葉綠素總量，P4T1、P4T2和P4T3處理組合提高了葉綠素b和類胡蘿卜素含量，且處理間差異顯著 (P＜ 0.05, 表9)。

表5 PP333、TIBA及兩者交互作用對大葉黃楊葉片含氮化合物影響的方差分析Table 5 ANOVA analysis on the effects of PP333, TIBA and their interaction on nitrogen-containing compounds in leaves of B. megistophylla seedlings

表6 PP333的主效應對大葉黃楊葉片含氮化合物的影響Table 6 Main effect of PP333 on nitrogen-containing compounds in leaves of B. megistophylla seedlings

表7 PP333和TIBA的交互效應對大葉黃楊葉片含氮化合物的影響Table 7 Interactive effect of PP333 and TIBA on nitrogencontaining compounds in leaves of B. megistophylla seedlings

3 討論

3.1 PP333和TIBA對大葉黃楊根系氮吸收的影響

大葉黃楊在營養生長期內，同時噴施PP333和TIBA使得大葉黃楊植株根系有較高的氮素吸收和積累能力，其中最為顯著的是提高了細根根系中全氮、硝態氮和游離氨基酸含量，表明PP333和TIBA對增強大葉黃楊苗木細根對氮的吸收能力有顯著的協同促進作用，這與植物生長延緩劑的配合噴施能最大程度促進水稻 (Oryza sativaL.)[20]、楊梅(Myrica rubraSie b. et Zuca)[13]、花卉植物[21]根系對全氮、硝態氮的吸收等的研究結果相一致。

PP333和TIBA促進細根含氮化合物含量的途徑主要通過對根系的影響實現：1) 植株內源激素GA3類抑制根系形成和生長[10-11]，而PP333能夠抑制GA3的合成，從而促進了根系生長；TIBA則通過促進植株內ETH的形成，并在ETH與IAA協調控制作用下，起到促進植物側根形成的作用[22-23]；2) 植物生長延緩劑通過抑制新梢生長使植株矮化，使得地上部的營養消耗顯著降低，根部ABA含量增加，促進地上部積累的同化物向下運輸，從而有利于根系生長和根系活力的提升[24]。并且，植物生長延緩劑對細根的作用效果顯著優于中根，粗根作用效果則不顯著，導致大量細根增生，顯著增加吸收面積，因此在PP333、TIBA及兩者的交互作用下，促進了細根根系發達、根表面積增大，顯著增加了根系與土壤養分的接觸面積，通過截獲作用吸收更多的氮素營養而另一方面提高的根系活力又為植物根系吸收養分提供了充足的能量，從而促進根系對其高效吸收[25-26]。良好的根系形態發育增加了根系對氮素的接觸面積，生理功能的變化又影響了氮素營養向根部的遷移及根對其的獲取，從而顯著提升細根根系對全氮、硝態氮的吸收[27]。

表8 PP333、TIBA及兩者的交互作用對大葉黃楊光合色素含量影響的方差分析Table 8 ANOVA analysis on the effects of PP333 and TIBA on photosynthetic pigment content of B. megistophylla seedlings

表9 PP333和TIBA的交互作用對大葉黃楊光合色素含量的影響Table 9 Interactive effects of PP333 and TIBA on photosynthetic pigment content of B. megistophylla seedlings

3.2 PP333和TIBA對葉片中氮分配的影響

葉片氮存在的主要形式為蛋白質 (化學不溶蛋白和可溶性蛋白)，其他的氮以游離氨基酸、硝態氮(NO3-)[28]等形式存在。游離氨基酸是合成蛋白質的原料，硝態氮是合成其他有機氮的原料，可以調節其他含氮物質的量。

PP333和TIBA及其交互作用對葉片全氮有顯著的促進作用，這與張紅娜等對妃子笑荔枝 (Litchi chinensisSonn.)[29]、王麗特等對煙草 (Nicotiana tabacumL.)[30]和Sara等對水曲柳 (Fraxinus mandshuricaRupr.)[31]的研究一致。Matsoukis 等[5]研究表明，植株在植物生長延緩劑噴施處理下，生長受到抑制，葉面積指數下降、葉厚增加，因此“濃縮效應”是導致相對含量上升的原因之一，這也是大葉黃楊葉片在逆境條件下作出的反應。但在Huett等關于桃樹 (Amygdalus persicaL.)[32]和鄭濤等關于漳州水仙(Narcissus tazettavar.chinensis Roem.)[33]的試驗中，植物生長延緩劑的噴施降低了葉片氮含量，與本文結果不一致，表明不同植物種類葉片氮代謝對植物生長延緩劑的響應機制不同。

葉片是最主要的硝態氮累積和同化器官，促進葉片營養體硝態氮的再利用，有利于改善植株生長期的氮素營養狀況，提高氮素利用效率。本研究中，高濃度PP333能夠促進葉片硝態氮含量的提升，這可能是由于PP333促進了全氮葉片的分配，因此合成的硝態氮含量隨之增高；也可能是由于在PP333處理下，硝酸還原酶活性顯著提升[34]，而在生長期的葉片中硝酸還原酶與硝態氮含量呈正相關關系[35]，因此硝態氮有所積累。然而，PP333中低濃度、TIBA各個濃度以及PP333和TIBA交互作用，對硝態氮含量均無顯著變化，這與TIBA在一定程度上抑制植株中NO3-的轉運基因AtNRT1.1的基因表達量，并導致NO3-轉運蛋白合成受阻[36]，進而抑制了植物根系對NO3-的跨膜主動運輸能力有關。PP333、TIBA及其交互作用均能夠顯著提升葉片內光合色素含量。研究表明，PP333、TIBA等植物生長延緩劑對植株進行葉面噴施處理，均能夠不同程度地提高核桃 (Juglans regiaL.)[37]、毛竹[Phyllostachys heterocycla(Carr.) Mitford cv. Pubescens][38]等經濟作物，小麥 (Triticum aestivumL.)、馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)[39]等農作物，麻瘋樹 (Jatropha carcasL.) 等喬木[5,40]和草坪草葉片的光合色素含量，與本試驗結果一致。這可能是在PP333和TIBA處理下，植株新梢生長受到抑制，葉片面積顯著減小、葉厚增加，導致葉綠素含量相對增加；另一方面，植物生長延緩劑能夠調節植物營養生長和生殖生長之間的關系，并通過抑制營養生長而調節營養物質在葉片中的分配，從而為葉綠素合成提供了條件。

3.3 大葉黃楊氮分配機制對PP333和TIBA的響應

本試驗中，PP333、TIBA及其交互作用均促進了根系對氮的吸收和氮在葉片中的分配，然而PP333與TIBA對綠蘺植物具有延緩生長的作用[6-9]，這表明根系所吸收的氮素營養并未用于植株軸向生長，究其原因是植物生長延緩劑促進植物分蘗，增加莖的徑向生長和葉厚。劉梅等[41]研究表明，同一氮素水平下，根系呼吸速率和氮素積累量呈顯著線性負相關；胡鳳琴等[42]也通過研究證實了單個根 (構件) 的生長發育與其吸收的養分收益和自身建造、維持的消耗有關。因此，大葉黃楊根系在PP333、TIBA及其交互作用下所吸收的氮可能用于三個部分消耗：根系的生長消耗、根系呼吸消耗以及地上部徑向生長消耗[43]。氮在植物葉片的代謝過程中，通常有超過半數的氮會分配到葉綠體中參與光合作用，PP333、TIBA均促進更多的氮形成光合色素和可溶性蛋白，這兩種形式的氮參與葉片的光合作用[44]，另外縮小的葉面積和降低的新梢生長量改善了葉片光照和通風條件，促進對光能的捕捉和光合產物的生成，光合產物有利于植物生長。然而，PP333和TIBA對大葉黃楊株高的抑制和對葉面積的減少改變了營養物質(包括光合產生的有機養分) 的運輸路踐，促進了分蘗增加[45]和植株斜向平伸；另一方面，在PP333和TIBA作用下，根系的建成需要消耗更多營養，從而促進光合產物的向下運輸。綜上，這是導致在PP333和TIBA作用下，地下部分所吸收的氮素營養和分配給葉片的氮均增多，植株生長卻減緩的重要原因。氮在植物內的分配在一定程度反映其在不同環境下所采取的對策，即植物生長延緩劑對植株軸向生長形成抑制作用，又同時促進其根系發達，根系對于氮素營養的需求增多，因而顯著提升了根系對氮素的吸收，同時促進了葉片光合產物的增加及其向下運輸，從而增加地下部的生物量，生物量向資源受限制的資源方向分配，符合地上、地下的生物量分配的功能平衡原理[46]。

PP333對根系氮的吸收能力以及葉片不同形態氮含量的促進效果均優于TIBA，原因可能是：PP333抑制IAA的生物合成，從而促進其分解，然而TIBA只是抑制IAA的極性運輸[12]，不影響它的生物合成；PP333顯著抑制GA3的生物合成，而TIBA對其沒有影響；PP333抑制細胞分裂，TIBA則促進細胞分裂；PP333主要是通過木質部向上運輸，并不能通過韌皮部向下運輸[47]。然而本研究關于PP333、TIBA對大葉黃楊根系氮吸收和葉片氮分配的具體影響途徑討論尚淺，缺乏具體的生理生化過程和物質調整的試驗支撐，因此，在下一步的研究中應當從分子機理方面深入研究其作用途徑。

4 結論

PP333和TIBA交互效應對大葉黃楊根系氮吸收和葉片氮代謝存在顯著影響，其中對細根根系的全氮、硝態氮、游離氨基酸含量和葉片全氮、可溶性蛋白含量、光合色素含量提升效果最為顯著，這驗證了兩種植物生長延緩劑配合噴施的必要性。PP333、TIBA的主效應中，隨著PP333濃度上升，細根和中根根系氮以及不同形態氮含量、葉片氮及不同形態氮含量顯著增加，僅在高濃度TIBA處理時細根根系氮吸收能力和葉片可溶性蛋白、全氮含量提升效果顯著。除此之外，PP333相對于TIBA更能影響大葉黃楊苗木氮的生理代謝過程，且均在高濃度時影響最為顯著。根據大葉黃楊根與葉對氮素的吸收和分配機制對多效唑與三碘苯甲酸的交互效應和主效應的總體響應規律，在生產應用與園林綠化維護中，80 mg/L PP333+100 mg/L TIBA配合噴施對促進大葉黃楊細根氮代謝的生理進程效果最優，并最為顯著地增強葉色濃綠效果，優化景觀價值，對大葉黃楊單施80 mg/L PP333則是最為經濟地促進根系氮吸收和葉片氮分配的噴施處理。