自噬與凋亡在骨肉瘤中的作用

梁仁政,吉光榮

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院骨七科，哈爾濱 150001)

自噬是一種細胞保護機制，可以降解細胞內受損的細胞器、蛋白質等，從而維持細胞的穩態。然而過度的自噬也可引起細胞質和細胞器等的過度降解，導致細胞死亡。自噬與凋亡是細胞程序性死亡的兩種方式，兩者在發生過程中存在交叉，對于通過自噬無法處理的細胞，最終可能會誘導細胞凋亡。骨肉瘤是一種常見的，嚴重威脅兒童和青少年健康的惡性骨腫瘤[1]，來源于骨骼系統的結締組織，尤其好發于多發性骨髓瘤患者。70%的骨肉瘤患者的發病年齡為10～25歲，臨床表現為疼痛和腫脹[2]，如延誤診斷，會因腫瘤壓迫導致皮膚表面緊縮以及淺表靜脈曲張。骨肉瘤開放性活檢手術后常發生病理性骨折[3]。骨肉瘤可發生在任何骨骼，以長骨干垢端多見，膝關節最常受累，發生于膝關節的骨肉瘤占所有骨肉瘤的50%[4]。骨肉瘤具有浸潤性和遠隔轉移性，易發生血行轉移，最常轉移至肺。骨肉瘤惡性程度高且預后差，2年存活率僅為15%～20%[5]。大部分高分化骨肉瘤患者在手術治療前通常輔以順鉑、阿霉素以及甲氨蝶呤等化療3個月。近年來，隨著大劑量聯合化療的應用，無轉移的骨肉瘤患者5年生存率可達55%～70%，但發生轉移者5年生存率僅為5%～20%[6-7]。雖然輔助化療顯著提高了骨肉瘤患者的生存率，但仍有一些問題存在，如嚴重不良反應、復發、轉移性并發癥等，而化療耐藥是目前骨肉瘤治療的難點之一。現就自噬與凋亡對骨肉瘤發生以及治療的作用予以闡述。

1 細胞凋亡的相關分子機制

對于骨肉瘤的治療，最重要的是誘導腫瘤細胞凋亡、抑制骨肉瘤生長。近年來隨著新藥物的應用，患者的預后雖然有所改善，但化療耐藥仍普遍存在，成為骨肉瘤治療的難點[8]。凋亡信號的識別與促細胞凋亡藥物的研發為骨肉瘤的治療提出了新的策略[9]。

1.1凋亡信號通路 細胞凋亡是為維持內環境穩定，由基因調控的細胞自主的有序的死亡。迄今為止，已經發現14種凋亡相關蛋白，主要包括凋亡啟動因子、凋亡效應因子以及炎癥因子。凋亡信號通路包括外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑。外源性凋亡途徑是由死亡配體與死亡受體結合引發。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體超家族，包括腫瘤壞死因子受體1、Fas、重組人死亡受體3、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體2、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體1、死亡受體6、異位受體蛋白A以及神經生長因子，其誘導死亡信號復合體組裝，包括Fas相關死亡域蛋白(Fas-associating protein with a novel death domain，FADD)和啟動子蛋白胱天蛋白酶(caspase)-8/10。在復合物中，FADD與caspase-8/10相互作用介導FADD蛋白的水解和caspase-8/10的激活，激活的caspase-8/10裂解并激活效應蛋白(caspase-3、6、7)，隨后靶向裂解一系列細胞底物，導致細胞凋亡。

內源性凋亡途徑是由多種細胞內刺激因素誘導的[10]。在這條通路上，線粒體膜溶解導致促凋亡蛋白從線粒體膜間隙進入細胞質，這個過程依賴于凋亡小體。凋亡小體包括細胞凋亡蛋白酶原9、凋亡蛋白酶活化因子1以及細胞色素C，其可導致caspase-9的聚集和活化，活化的caspase-9切割并激活下游的效應凋亡蛋白酶(caspase-3、6、7)，導致細胞死亡。外源性和內源性凋亡通路存在共同點，在擴大凋亡級聯反應中發揮著積極作用。

1.2微RNA(micorRNA，miRNA)調節骨肉瘤細胞凋亡 p53、p21、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)1、結構性轉錄因子2、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)、蛋白激酶B等在凋亡通路中發揮著重要作用。有研究提出，miRNA通過調控制骨肉瘤細胞中與化學耐藥相關的因子，參與調節細胞凋亡[11]。miR-140的異常過度表達，增加了p53和p21蛋白的表達，提高了骨肉瘤對甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶的敏感性[12]。此外，miR-199a和miR-34a通過p53信號通路誘導人骨肉瘤細胞凋亡[13]。而miR-26a可靶向作用于IGF-1，抑制IGF-1在骨肉瘤中的表達，從而抑制腫瘤[14]。在骨肉瘤中，通過減少BCL2L2、MCL-1、IGF受體、MET等的表達，增加磷酸化蛋白激酶B和局部黏著斑激酶的表達也可起到抑制腫瘤的作用[15]。在人類骨肉瘤細胞中，miR-23a靶向調節PTEN的3′-非翻譯區，并負相調節PTEN的表達，通過激活蛋白激酶B/細胞外信號調節蛋白激酶通路，促進骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[16]。

1.3骨肉瘤中調節細胞凋亡的化合物 多柔比星和星形孢菌素可靶向誘導骨肉瘤U2OS細胞系中caspase-3和7的活化，并促進細胞凋亡[17]。開瑞坦可通過上調caspase-3和cspase-9的表達，增加caspase-3的裂解水平，抑制人骨肉瘤細胞在體外的增殖[18]。黃芩素可通過線粒體途徑誘導骨肉瘤細胞凋亡，又可通過上調熱激蛋白70的表達，部分阻止人骨肉瘤細胞的凋亡，并降低骨肉瘤對黃芩素的敏感性[19]。環糊精角叉菜堿、IGF-I受體酪氨酸激酶抑制劑可通過聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1及其裂解產物，抑制多重耐藥的骨肉瘤細胞增殖，并促進骨肉瘤細胞凋亡。環氧霉素(蛋白酶抑制劑)能顯著提高caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性以及Bax蛋白的水平，誘導骨肉瘤細胞凋亡[20]。

1.4骨肉瘤中調節細胞凋亡的蛋白因子 抑癌蛋白M屬于白細胞介素6家族，通過激活信號轉導及轉錄激活因子、p53以及核轉移，增加Bax/Bcl-2的比值，最終導致成骨細胞凋亡[21]。Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)家族的轉錄因子具有調節細胞生長和分化的作用，Runx2可直接靶向作用于Bax，是骨肉瘤細胞的促凋亡因子。此外，Runx2的丟失促進了骨肉瘤對化療誘導細胞凋亡的敏感性[22]。FOXO轉錄因子，特別是FOXO1，在骨肉瘤細胞中通過Wnt/β聯蛋白途徑，起抑制腫瘤細胞的作用[23]。放線菌素D是一種廣為人知的轉錄抑制劑，通過增加裂解的caspase-3和放線菌素D的水平和治療時間，抑制骨肉瘤細胞的增殖，促進其凋亡[24]。EZH2是聚合酶抑制劑2的催化亞基，敲除EZH2可導致抗凋亡的Bcl-2降低，增加促凋亡的Bax、Bak以及細胞色素C在細胞質的表達，表明EZH2通過內源性凋亡途徑抑制細胞凋亡[25]。另外，EZH2也可通過負性調控兩種促細胞凋亡的miR-205和miR-31，抑制細胞凋亡[26]。

2 自噬的相關分子機制

至今，自噬對骨肉瘤化療敏感性和化療耐藥的作用尚未明確。在骨肉瘤治療過程中，自噬既可以提高化學敏感性，也可以提高化學耐藥性。

2.1自噬的信號通路 自噬是一個高度保守的程序，營養物質缺乏、生長因子、激素、細胞內能量信息以及細胞應激如缺氧、病毒感染等均可觸發。目前為止，共發現30多個自噬相關基因(autophagy associated gene,Atg)[27]。一些分子復合物在自噬過程中是必不可少的，根據其在自噬過程中的功能分為Atg1蛋白激酶復合物、Ⅲ類磷脂酰肌醇-3-激酶、Beclin1、Atg12共軛系統、Atg8共軛系統以及Atg9。Atg1蛋白激酶復合物是誘導自噬所必需的；Ⅲ類磷脂酰肌醇-3-激酶-Beclin1復合物是囊泡融合所必需的；Atg12-Atg5共軛結構對于囊泡的延展是必要的。

2.2自噬與骨肉瘤的治療

2.2.1自噬提高化療的敏感性 類黃酮黃體素通過上調beclin1的表達，促進阿霉素誘導的人類骨肉瘤U2OS細胞自噬，產生細胞毒性，導致U2OS細胞死亡[28]。雄烯二酮衍生物在化療藥物的作用下，通過降低高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)的水平，提高化學敏感性，克服骨肉瘤耐藥性[29]。雙吲哚生物堿沃卡胺是一種自噬誘導劑，對野生型和多重耐藥的腫瘤細胞具有細胞毒性作用，其通過增加微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)的表達和轉化促進細胞凋亡[30]。2-甲氧基雌二醇在自噬相關蛋白7(autophagy-related protein 7，ATG7)表達的條件下，通過誘導LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ，促進人類骨肉瘤細胞自噬體形成[31]。此外，自噬可能在抗2-甲氧基雌二醇介導的骨肉瘤中起重要作用。

2.2.2自噬與骨肉瘤的化學耐藥性 在骨肉瘤細胞中，HMGB1的水平是升高的，其介導的自噬也會促進化療耐藥[32]。miR-22在化療期間可代償性增多，過度表達的miR-22靶向作用于HMGB1，從而抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移，并抑制其介導的自噬[32-33]。上調HMGB1可增加磷脂酰肌醇-3-激酶復合物的形成，并通過與Bcl-2競爭結合Beclin1，刺激自噬體成熟。HMGB1和自噬的抑制增加了體內外骨肉瘤細胞對藥物的敏感性，且HMGB1與Beclin1的相互作用需要人類unc-51樣激酶1(unc-51-like kinase 1，ULK1)復合物的存在，其相互作用促進磷脂酰肌醇-3-激酶復合體在自噬過程中的形成，提示HMGB1介導的自噬促進了骨肉瘤細胞的耐藥[34]。另外，高遷移率族核小體結合的結構域5在骨肉瘤中高表達，特別是在治療后的腫瘤中。過度表達的高遷移率族核小體結合的結構域5降低了體外骨肉瘤細胞的化學敏感性，并通過上調自噬以及ULK1、Beclin1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的水平增加耐藥性[35]。miR-101降低了Atg4的水平，Atg4是兩個共軛系統的調節器，在骨肉瘤中可抑制阿霉素誘導的自噬囊泡的形成，并通過miR-101抑制自噬和骨肉瘤細胞對化療的敏感性[36]。

3 自噬與凋亡的相互作用

自噬在骨肉瘤進展中的確切作用目前尚不清楚。有報道稱，自噬既可以促進細胞存活也可以促進細胞死亡[37]。自噬與細胞凋亡密切相關，深入了解自噬，并利用自噬調節細胞凋亡對骨肉瘤的治療有重要意義。

3.1細胞凋亡與自噬具有協同作用 二氨基吖啶具有劑量依賴性抑制骨肉瘤細胞增殖的作用，并通過協調細胞凋亡與自噬發揮抗癌作用[38]。南蛇藤醇是一種三萜烯藥物，具有強效的抗腫瘤作用，其在骨肉瘤細胞中通過活性氧類/c-Jun氨基端激酶信號通路，誘導細胞凋亡和自噬[39]。

3.2自噬與細胞凋亡之間的對抗關系 Beclin1是一種重要的自噬調節蛋白，與許多疾病如癌癥、衰老以及退行性疾病相關。Atg6和Beclin1可使腫瘤細胞的生長、侵襲以及轉移減少，表明抑制自噬對化療誘導的細胞毒性有積極作用，增加了抗癌藥物的治療功效[40]。熱激蛋白90抑制劑格爾德霉素通過抑制蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/p70S6K信號轉導通路，在KTHOS細胞中誘導自噬[41]。在KTHOS細胞中，格爾德霉素也能誘導凋亡蛋白酶依賴性凋亡通路，與自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤聯合，可增強其誘導的細胞凋亡[41]。在骨肉瘤細胞中，雷帕霉素可抑制細胞增殖，并減少哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路成分磷酸化骨肉瘤細胞，Spautin-1(一種新型自噬抑制劑)可抑制雷帕霉素誘導的保護機制，從而有效誘導了細胞凋亡[42]。 Dihydroptychantol A是一種大環雙聯芐衍生物，在人類骨肉瘤中可誘導自噬以及與p53途徑相關的凋亡。此外，敲除內質網激酶R樣蛋白激酶受體可抑制自噬，最終導致骨肉瘤細胞凋亡[43]。

4 結 語

關于細胞凋亡和自噬如何影響骨肉瘤細胞的增殖和侵襲，以及影響骨肉瘤耐藥的潛在因素已經探討了很多，但仍有很多問題需要解決。目前關于骨肉瘤的治療，耐藥是最大阻礙。自噬到底是增強還是降低了骨肉瘤的耐藥，目前還尚未研究清楚。此外，細胞自噬與凋亡之間的相互作用很復雜，自噬可提高細胞的生存能力和壞死細胞數量；而細胞凋亡、自噬均可以誘導腫瘤細胞的死亡，但相互作用途徑還有待研究，深入了解細胞的自噬與凋亡，也為骨肉瘤的治療提供新的方法。