淫羊藿次苷Ⅱ通過改善內質網應激和caspase-12信號改善SHR大鼠左心室功能

吳雨婷，李葉麗，付 舒，岳 云，孫瑞敏，楊丹莉

(遵義醫學院，基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563003)

心力衰竭是導致全球發病率和死亡率升高的主要原因，其中高血壓是最主要的危險因素，大約75%的心衰患者伴有血壓升高[1]。心肌細胞凋亡是決定心臟結構和功能的關鍵因素，在心力衰竭患者和動物模型中都有心肌細胞凋亡[2]。心肌細胞凋亡除了使細胞數目減少，還可阻止氧化磷酸化過程，減少ATP生成，導致細胞能量障礙[3]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)在心肌細胞凋亡中起重要作用[4]。受應激刺激時，GRP78與內質網跨膜信號轉導子解離，使之激活，從而激活一系列凋亡信號，導致細胞凋亡[5]。Caspase-12酶原的激活是ERS誘導細胞凋亡的特異性分子之一[6]。

淫羊藿可用于治療心血管疾病、神經退行性疾病和性功能障礙。淫羊藿次苷Ⅱ (icariside Ⅱ, ICS Ⅱ)是淫羊藿的活性成分之一，也是淫羊藿苷的活性代謝產物。淫羊藿苷能夠通過抑制ERS，減輕衣霉素誘導的H9c2細胞凋亡[7]。我們之前的研究已經表明，ICS Ⅱ能夠降低自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHRs)血壓、減少心肌細胞凋亡[8]。因此，本研究旨在證實ICS Ⅱ改善左心室功能的作用，并初步探討其機制是否與ERS及caspase-12信號有關。

1 材料

1.1實驗動物30只14周齡的♂SHRs，6只魏凱二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號: SCXK(京)2012-0001。

1.2藥物與試劑ICS Ⅱ，購自南京澤朗醫藥有限公司(批號：FY17460602，經高效液相色譜法檢測其純度≥ 98%，有效期24個月)，將ICS Ⅱ溶于適量雙蒸水中，并加入纖維素鈉制成混懸液，每次灌胃前先超聲混勻。RNA逆轉錄試劑盒、熒光混合物、GRP78和GAPDH引物(TaKaRa生物工程公司)；GRP78、cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3抗體(美國Abcam公司)；GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)。

1.3儀器Vevo2100小動物超聲檢測儀(加拿大VisualSonics公司)；RNA逆轉錄儀(德國Eppendorf公司)；i-mark酶標儀、real-time PCR擴增儀、迷你 PROTEAN3電泳儀、迷你Trans-Blot轉移系統、CCD成像系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1實驗動物分組WKY作為空白對照組，SHRs隨機分為模型組、ICS Ⅱ低、中、高劑量組和陽性藥組，每組6只。ICS Ⅱ組分別灌胃給予ICS Ⅱ 4 、8、16 mg·kg-1至26周齡，陽性藥組給予氯沙坦20 mg·kg-1，空白組和模型組給予等體積雙蒸水。

2.2大鼠左心功能檢測在第26周最后一次給藥結束后，大鼠麻醉后剃除左側胸部鼠毛，將其固定在檢測臺，并涂抹藕聯合劑。然后使用Vevo2100小動物超聲設備獲取M型超聲心動圖。測量左心室舒張末期內徑、左心室后壁舒張末期厚度、射血分數和短軸縮短率。記錄連續10個心動周期的平均值。

2.3Real-timePCR法檢測左心室組織中GRP78mRNA水平提取大鼠左心室組織RNA，經兩步法-聚合酶鏈反應后，檢測GRP78、GAPDH mRNA的水平。反應條件為：第1階段：95 ℃預變性10 min；第2階段：PCR反應(95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，進行40次循環)；第3階段：熔解曲線分析(從55 ℃開始，每5 s下降0.5 ℃，進行80次循環)。引物序列見Tab 1。用相對定量法計算目的基因水平，以PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環數(cycle threshold，Ct值)為統計參數，計算下列數據，Ct值的平均值=(Ct l+Ct 2)/2(重復管)；dCt=Ct值的平均值-中間值(相同檢測基因的不同樣品Ct值的平均值中居中的值)；基因的表達=2-dCt；相對定量=目的基因的表達/內參基因的表達，將空白組mRNA表達設為1。

Tab 1 Primer pairs used in real time PCR

2.4Westernblot法檢測左心室組織中GRP78、cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白的表達取大鼠左心室組織30 mg，剪碎后加入1 mL RIPA裂解液，冰上勻漿后，加入PMSF、蛋白磷酸酶抑制劑各10 μL，靜置30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，取上清液獲取蛋白樣本，BCA法測定樣本濃度。蛋白上樣量為10 μL(含30 μg蛋白)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。然后轉至PVDF膜上，5%蛋白封閉液封閉2.5 h，一抗GAPDH(1 ∶10 000)、GRP78 (1 ∶1 000)、cleaved-caspase-12 (1 ∶1 000)、cleaved-caspase-9 (1 ∶1 000)、cleaved-caspase-3 (1 ∶2 000) 4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶2 000)常溫孵育1.5 h，ECL化學發光顯色，CCD成像系統獲取圖像。將WKY組蛋白表達設為1。

3 結果

3.1ICSⅡ對SHRs左心功能的影響Fig 1超聲結果顯示，與WKY組相比，SHR組左心室舒張末期內徑和左心室后壁舒張末期厚度增加(P<0.05)，而射血分數和短軸縮短率降低(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ中、高劑量及陽性藥組左心室舒張末期內徑和左心室后壁舒張末期厚度降低(P<0.05)，射血分數和短軸縮短率增加(P<0.05)。

3.2ICSⅡ對SHRs左心室組織中GRP78mRNA和蛋白水平的影響與WKY組相比，SHR組GRP78 mRNA和蛋白水平明顯增加(P<0.05)，經ICS Ⅱ和氯沙坦治療后，GRP78 mRNA和蛋白水平不同程度降低(P<0.05)，見Fig 2。

Fig 1 Effect of ICS Ⅱ on left ventricular function in SHRs n=6)#P<0.05 vs WKY; *P<0.05 vs SHR

Fig 2 Effect of ICS Ⅱ on levels of GRP78 mRNA(A) and protein(B) in left ventricle tissues of SHRs n=6)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

3.3ICSⅡ對SHRs左心室組織中cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白水平的影響如Fig 3所示，與WKY組相比，SHR組cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白表達明顯上調(P<0.05)；而給予ICS Ⅱ各劑量及氯沙坦治療后，cleaved-caspase-12、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白水平下調(P<0.05)。

Fig 3 Effect of ICS Ⅱ on levels of cleaved-caspase 12/9/3 protein in left ventricle tissues of SHRs n=3)

#P<0.05vsWKY;*P<0.05vsSHR

4 討論

高血壓是全球常見疾病，是心腦血管事件的主要危險因素[9]。改善左心功能和預防高血壓心臟病是治療高血壓的重要策略[10]。在本研究中，我們檢測了大鼠的左心室功能，模型組左心室舒張末期內徑和后壁舒張末期厚度增加，而射血分數和短軸縮短率降低，表明26周齡SHRs左心功能減退，而ICS Ⅱ能夠改善SHRs左心功能。在課題組之前的研究中，已經確定ICS Ⅱ能夠降低SHRs血壓，并減少心肌細胞凋亡[8]，血壓降低是其心肌細胞凋亡減少的原因之一。在本研究中，課題組基于ERS-心肌細胞凋亡，進一步研究ICS Ⅱ改善左心功能的作用機制。

內質網是一種廣泛存在于真核生物的膜性細胞器，主要負責調節蛋白質合成、折疊、運輸和細胞內鈣水平[11]。血壓升高引起細胞內環境變化，阻斷蛋白質加工，導致內質網中未折疊/錯誤折疊蛋白累積[12]。GRP78是促進蛋白質正確折疊的重要分子伴侶，其水平間接反映了ERS水平[13]。本研究中，SHR組左心室GRP78蛋白表達明顯上調，表明SHRs左心室心肌細胞發生了ERS。同時，在中、高劑量ICS Ⅱ組，上調的左心室GRP78蛋白表達被抑制，表明ICS Ⅱ可抑制SHRs心肌細胞的ERS。文獻報道，ERS可通過激活一系列凋亡信號，誘導細胞凋亡[5]。結合既往研究中，ICS Ⅱ能夠減少SHRs心肌細胞凋亡[8]，因此，我們推斷ICS Ⅱ改善SHRs左心室功能，與其抑制ERS、減少心肌細胞凋亡有關。

caspase-12途徑是ERS-細胞凋亡的途徑之一。caspase-12屬于啟動子半胱天冬酶，具有長的N末端前結構域，介導蛋白質復合物的形成，caspase-12酶原可在ERS誘導的細胞凋亡中被激活。caspase-12酶原與腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2, TRAF2) 結合形成復合物，當發生ERS時，TRAF2從該復合物中解離，誘導caspase-12的激活[14]。此外，caspase-12酶原還可單獨位于內質網外膜，胞質中Ca2+升高導致鈣蛋白酶活化，并轉位至內質網膜，激活caspase-12。而活化的caspase-12可以啟動一個正反饋回路，通過caspase-9的活化來激活caspase-3[15]。caspase-3是執行凋亡的半胱天冬酶，通過在天冬氨酸殘基處切割產生p12和p17亞基而激活，激活的caspase-3切割各種DNA修復酶和結構蛋白，導致細胞凋亡[16]。本研究中，模型組cleaved-caspase-12/9/3蛋白水平增加，表明26周齡SHRs通過激活caspase-12信號，導致心肌細胞凋亡；而ICS Ⅱ能夠下調caspase-12信號，減少心肌細胞凋亡，進而改善左心室功能。

綜上，ICS Ⅱ能夠改善SHRs左心室功能，其作用機制與改善ERS，下調caspase-12信號有關。

(致謝：本實驗在遵義醫學院基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室完成，感謝吳棟清、吳芹、黃波提供的幫助!)