黃粉蟲主要活性物質的提取研究進展

李寧，冉學文，熊曉莉

(重慶工商大學 重慶市特色農產品加工儲運工程技術研究中心，重慶 400067)

黃粉蟲是一種人工養殖的資源昆蟲，其營養價值豐富，體內含多種營養物質，不僅可作為飼料，還可用于制作高質量的蛋白食品[1]。以黃粉蟲幼蟲(干基)為例：含蛋白質多達48%～55%，脂肪27%～30%、碳水化合物10%～12%，尚含有維生素、激素、酶及無機鹽磷、鐵、鉀、鈉、鈣、鐵、鋅、硒、鎂、銅、錳等，營養價值很高[2-3]。除此之外，黃粉蟲還含有對人體有特殊作用的幾丁質[4]、抗菌肽[5]、凝集素[6]等多種功能活性物質，可改善人的記憶能力、抗疲勞、抗組織缺氧、延緩衰老、降血壓、緩解貧血等功能[2，6-7]，在食品、醫療保健、特種養殖、生物柴油等領域具有較好的應用前景[8-12]。目前，關于黃粉蟲體內活性物質的提取、分離、純化及應用的研究并不多。本文綜述了黃粉蟲體內的降血壓肽、抗菌肽、抗氧化肽、黃酮等具有生物活性物質的提取、分離及純化工藝，以及這些活性物質在食品保健領域的應用前景，為黃粉蟲的規模化、資源化利用提供參考。

1 活性物質提取

1.1 多肽

1.1.1 降血壓肽 高血壓為常見的心血管疾病，并會引起嚴重的并發癥。目前，臨床常用的抗高血壓藥主要有利尿劑、β-受體阻滯劑、鈣離子通道阻滯劑、血管緊張素Ⅱ-受體拮抗劑等[13]。以上藥物降壓效果明顯，但同時具有過度降壓、皮膚過敏、疲乏等副作用，而從天然產物中獲得的降血壓肽因其降血壓效果明顯，毒副作用低、安全、有效，已成為目前研究的熱點[14]。降血壓肽是一種血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑，通過抑制ACE的活性實現降低血壓的目的。研究證實，末端為疏水性氨基酸，更有利于與ACE結合[15]。因黃粉蟲體內含有較多的疏水性氨基酸，故黃粉蟲可作為提取ACE抑制劑的原料[16-17]。

目前，從黃粉蟲體內獲得降血壓肽，主要是通過酶法，該法具有以下優點：反應條件溫和，副反應少，選擇性強、無需高溫高壓設備等優點。酶解過程大致如下：篩選酶、酶水解、酶滅活、粗分離、濃縮、純化、干燥。常用到的酶有Alcalase堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和膠原蛋白酶等中的一種或幾種。

以黃粉蟲蛋白粉為原料，經木瓜蛋白酶酶解，經單因素和優化實驗后，得出最優的工藝條件：70 g/L底物濃度，1%加酶量，于pH 6.5、55 ℃下反應7 h。所得產物的ACE抑制率達58.86%[15]。

以脫脂黃粉蟲幼蟲蛋白粉為原料，在以下條件下酶解，可獲得對ACE抑制作用較強的酶解產物：Alcalase酶，3%蛋白粉，加酶量4 000 U/g蛋白粉，pH 8.5、50 ℃反應，20%水解度，此時獲得的酶解液，其對ACE的IC50值為0.39 g/L[18]。研究進一步證實，水解過程中施加超聲波處理可以加快水解速率。短時間超聲波處理(5 min內)可使Alcalase活性增強，但長時間超聲波處理會降低其活性。黃粉蟲幼蟲在酶解過程中會伴隨大量色素物質生成，導致酶解液為棕黃色，需進行脫色處理。實驗表明，3%粉末活性炭用量在pH 3、40 ℃下吸附50 min，黃粉蟲幼蟲降血壓肽酶解液脫色率達85.3%，脫色后的水解液對ACE的抑制率達70.8%[19]。

1.1.2 抗菌肽 抗菌肽是一類小分子多肽類物質，廣泛存在于自然界的生物體中，具有分子量小、熱穩定、廣譜抗菌、水溶性好等特點，在醫藥、水產與畜禽養殖、種植、食品等領域有良好的應用前景，近年來是國內外的研究熱點[20]。

黃粉蟲受刺激或被感染后引起免疫應答反應會產生抗菌肽，其數量和抗菌效果受誘導方法、蟲態、誘導時間、誘導次數、外源刺激物種類、外源刺激物的強度(濃度)等因素的影響。黃粉蟲抗菌肽種類多，不同的誘導和分離方法可獲得不同的抗菌肽。因此，從蟲體中提取、分離、純化仍然是抗菌肽研究的基礎和重要組成部分。

索相敏等[21]采用毛細管提取法提取黃粉蟲抗菌肽：將消毒后的黃粉蟲，剪去其一對足，用毛細管收集其血淋巴。將血淋巴于低溫離心后，將上清液透析，再次離心，獲得抗菌肽含量較高的上清液。該法取出時未加其他溶劑，減少污染和分離難度，但黃粉蟲個體較小，要得到大量的抗菌肽很困難。故一般采用全蟲液氮速凍、高速勻漿后加入合適的緩沖液提取。

以0.1%三氟乙酸作為提取液，經粗提、Sephadex-G50預純化、Sephadex Peptide凝膠柱再純化、Resource 15RPC反相柱純化后，產物抗菌活性較粗提物明顯增強，可能是勻漿法中，抗菌肽所占的比例太小，使其不能發揮作用[22]。從以上分析也可以看出，抗菌肽的成分復雜，用勻漿法提取分離的步驟冗長，收率不高。

王小平等[23]將誘導分離后的抗菌肽，用于測試對9種動物病原細菌和10種植物病原細菌的抑菌效果，結果見表1。

表1 黃粉蟲抗菌肽對病原細菌的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of Tenebrio molitor antibacterial peptide on pathogenic bacteria

由表1可知，黃粉蟲抗菌肽雖然具有廣譜抗菌性，但不是對每種菌都有效。當然，這也可能與誘導條件、提取分離條件、抑菌測試條件、抑菌濃度等因素有關，如王立新等制備的黃粉蟲抗菌肽，對金黃色葡萄球菌的抑制效果優于對大腸桿菌的抑制效果[24]。程璟俠[25]用超聲誘導黃粉蟲后，提取分離了其體內的抗菌肽，并從這些抗菌物質中，分離出活性最強的一種抗菌肽作為K562癌細胞的抑制劑，以羥基脲為對照組。實驗證實，抗菌肽對K562細胞增殖抑制效果明顯高于對照組。抗菌肽使大量的細胞阻滯在G1期(DNA合成前期)，抑制了S期DNA合成，說明抗菌肽可通過影響細胞周期來發揮抗K562細胞的作用。

目前，天然抗菌肽仍存在以下問題：①抗菌活力和抗菌譜和傳統抗生素相比仍顯不足；②用法用量不清：其毒理性和藥理藥效方面的研究還需深入；③尚不能規模化生產：因生物體中天然抗菌肽含量很低，提取工藝繁瑣，得率不高；抗菌肽的天然結構及活性難以維持，這些大大限制了其大規模應用。當然，抗菌肽有自身的特點及優勢，隨著研究不斷深入，仍有望成為一種新型生物制劑[26]。

1.1.4 抗凍多肽 抗凍多肽(蛋白)可以非依數性地降低溶液的冰點，而不影響溶液的熔點，在食品、藥品冰凍、貯藏、運輸和解凍過程中能抑制重結晶，并能減少滴液。Ramsay等[30-31]率先在黃粉蟲幼蟲體內發現了具有凝固點抑制活性的蛋白(FPDP)。后來的研究人員從黃粉蟲體內分離得到了較純的FPDP，大致分離過程如下：將處于-1 ℃下黑暗環境中2周的黃粉蟲幼蟲，在50%乙醇2次勻漿，離心取上清液。用不同的Sephadex離子交換樹脂吸附蛋白質，然后以NaCl溶液洗提，洗提液通過超濾膜濃縮，濃縮液再通過SephadexG50凝膠過濾、離子交換色譜脫鹽、等電聚焦等作用后，得到純度較高的FPDP[32]。現有研究表明，在相同濃度下，黃粉蟲抗凍蛋白的熱滯活性是一般魚類抗凍蛋白的10倍～100倍。Graham等[32]從黃粉蟲幼蟲中分離的抗凍蛋白在1 mg/L的濃度下可以達到5.5 ℃的熱滯活性，其抗凍活性是魚類的數倍甚至上百倍，富含半胱氨酸、蘇氨酸，相對分子量8 400。目前抗凍蛋白市場售價很高，限制了抗凍蛋白在商品中的應用。

1.2 黃酮

汪璇[33]以脫脂黃粉蟲粉為原料，在超聲波輔助下提取黃粉蟲黃酮，優化的提取條件為：蟲粉∶水=1∶18 g/mL，適當的超聲提取條件(30 min、58 ℃、功率380 W)，得到粗黃酮(CF)提取量為11.47 mg/g黃粉蟲。然后用XDA-1型大孔吸附樹脂對粗黃酮進行精制，獲得最佳分離條件：上樣液1.0 g/L，pH 5，2 BV/h 吸附流速、2 BV樣量；洗脫2 BV/h、60%乙醇、3 BV洗脫液體積，經純化后，黃酮純度由3.74%提高到16.34%，得到精制黃酮(PF)。

1.3 酶

1.3.1 纖維素酶 纖維素酶可對纖維素分子進行降解，是一類具有特定催化功能的活性蛋白質。冰浴條件下解剖出黃粉蟲的腸道，按蟲重和溶液體積比1∶1加入0.2 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，冰浴勻漿后，迅速在4 ℃、15 000 r/min條件下離心10 min，取上清液為纖維素酶的粗酶液，經檢測，在黃粉蟲幼蟲腸道內發現了2種纖維素消化酶：內切-β-1，4-葡聚糖酶(Endo-1，4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)[34]。

1.3.3 乙酰膽堿酯酶 乙酰膽堿酯酶(AChE)可使神經遞質乙酰膽堿在完成神經興奮的傳遞后盡快降解，以維持生物體內的神經沖動正常傳遞，是神經傳導過程中的一種關鍵酶。取黃粉蟲幼蟲胸部(頭部)，按1∶10 g/mL比例加入磷酸鈉鹽緩沖液，勻漿。4 ℃下，將勻漿液離心30 min，得粗酶液。將粗酶液過層析柱精制(SephadexG-200、洗脫液為磷酸鈉鹽緩沖液，洗脫12 h)，得到純化倍數18.84的AChE。研究還表明，黃粉蟲體內占總活性75%左右的AChE主要集中在其胸部和頭部，幼蟲相應部位的活性明顯低于成蟲[36]。

1.3.4 超氧化歧化酶 超氧化歧化酶(SOD)是一類源于生命體的活性物質，能催化超氧陰離子發生歧化反應，消除新陳代謝中產生的一些有害物質，具有抗衰老、調節機體代謝、抑制心腦血管疾病、抗腫瘤、增強免疫力等功能，在醫藥、日用化工、保健食品等領域是一種重要的添加劑。原料不同，SOD的制備方法不同。目前，提取SOD的主要原料為動物血、植物組織、微生物。吳蕾等[37]報道了黃粉蟲中SOD的提取、純化方法。取黃粉蟲干粉，與磷酸鈉緩沖液一起研磨，冷凍離心，收集上清液，用(NH4)2SO4沉淀雜蛋白，冷凍離心，得上清液。再次將沉淀溶解于上述磷酸鹽緩沖液，靜置離心，棄去沉淀，透析、脫鹽、濃縮得到純化的SOD，經鑒定為Cu-Zn-SOD。

1.4 抗凝集素

血栓性疾病是近年來威脅人類健康的最嚴重疾病之一，目前臨床多以抗凝、溶栓藥及抗血小板等藥物防治。由于傳統藥物的局限性，凝血因子Xa抑制劑成為了研究的熱點[38]。Lee等[6]將凍干的黃粉蟲的幼蟲，用含有1%醋酸的乙醇溶液回流，然后將粗提物懸浮在水中，然后依次用正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯提取，將乙酸乙酯提取物部分用色譜進行分離，可得到具有抗血栓和抗血小板凝集作用的化合物L-脯氨酰-L-酪氨酰和N-乙酰酪胺，這些化合物有望成為一種預防或治療血管性疾病的藥物。

1.5 殼多糖

殼多糖在醫療保健、食品添加劑、植物生長調節劑、環境保護等方面具有良好的應用價值[39-40]。從黃粉蟲提取殼多糖，具有原料來源穩定、含量豐富、產品灰分含量低、提取條件相對溫和等優勢，提取的方法主要有酸堿法、酶法、微生物法[39-42]。課題組將黃粉蟲殼聚糖，加入少量稀酸和過氧化氫混合液，置于50 ℃恒溫處理5 h，經中和、醇沉、離心后，收集沉淀，干燥，即可得到水溶性的殼多糖。研究證實，制得的水溶性殼多糖，對大腸桿菌具有很好的抑制作用，具有成膜作用，可用于果蔬保鮮、醫療保健、消毒等方面。將水溶性殼多糖用于鮮切蘋果的保鮮實驗中，可使蘋果的褐變、重量損失率和硬度相對于對照組分別降低66.8%，19.7%和39.3%，有機酸損失不明顯，保鮮效果優于殼聚糖和其他保鮮劑[43-45]。

2 展望

黃粉蟲作為一種潛在的資源，因具有容易獲得、蛋白質含量高、營養結構合理、加工特性良、活性物質高等優點而引起了廣泛的關注。黃粉蟲集多種功效于一體的活性物質于一身，這在天然食物、藥物資源類物質中并不多見。黃粉蟲養殖雖然有多年的歷史，但對黃粉蟲的研究還僅停留于較初級階段，對其體內活性物質種類、提取工藝、成本控制、應用領域等問題，尚有很多亟待解決的問題，實現對黃粉蟲大規模的工業化應用，仍有較大的研究空間。