下調SIRT1表達對子宮內膜癌細胞增殖及凋亡的影響

王曉華，李 輝，李 俊，楊 旭

1)云南省第二人民醫院產科 昆明 650021 2)云南省第二人民醫院婦科 昆明 650021 3)云南省第二人民醫院心血管病中心 昆明 650021

惡性腫瘤是一個世界范圍內的公共衛生問題。子宮內膜癌為常見的上皮性惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生命健康。子宮內膜癌的發病機制與癌基因、抑癌基因異常表達有關，研究其發病機制對于腫瘤治療具有重要意義[1]。沉默信息調節因子1(silence information regulator 1,SIRT1)屬于Sirtuin蛋白家族成員，是酵母沉默信號調節因子2在人體組織中的類似物，在人體多種組織和器官中均有表達，能夠調控細胞增殖、炎癥、新陳代謝等病理生理過程[2-3]。SIRT1在人鱗狀上皮細胞癌、基底細胞癌等腫瘤組織中高表達，參與癌細胞生長過程[4-5]。目前已經有報道[6]顯示，SIRT1在子宮內膜癌組織中的陽性率高于正常子宮內膜組織，SIRT1在子宮內膜癌中可能發揮癌基因的作用。本研究探討下調SIRT1對子宮內膜癌細胞增殖及凋亡的影響，為靶向治療子宮內膜癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料子宮內膜癌細胞Ishikawa購自上海復祥生物科技有限公司。SIRT1 shRNA重組慢病毒和陰性對照shRNA慢病毒由北京英茂盛業生物科技有限公司構建。活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)抗體購自美國Abbkine公司，活化的轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)抗體購自上海鈺博生物科技有限公司，細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗體、P21抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，SIRT1抗體購自上海安妍生物有限公司，山羊抗HRP標記的二抗購自美國Abcam公司，PrimeScript RT reagent Kit購自TaKaRa公司，SYBR Green Real-time PCR試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2實驗分組Ishikawa細胞分為空白對照組、干擾組和陰性對照組。細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，同時在細胞培養液中添加青鏈霉素雙抗?？瞻讓φ战M不處理，干擾組和陰性對照組細胞分別感染SIRT1 shRNA和陰性對照shRNA慢病毒，MOI=30，在熒光顯微鏡下觀察其感染效率高于85%。

1.3qRT-PCR測定SIRT1mRNA的表達取3組細胞，Trizol法抽提RNA，以PrimeScript RT reagent Kit反轉錄合成cDNA。PCR引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列為：SIRT1 上游 5’-CTTGCCTCATCTGCATTTT-3’，下游 5’-ATT AGGCCAGCATTTTCTCA-3’；GAPDH上游 5’-AG GTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’， 下游 5’-CGCTCCT GGAAGATGGTGAT-3’。反應程序：90 ℃ 30 s；95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。用SYBR Green Real-time PCR試劑盒對SIRT1表達水平進行定量，以GAPDH作為參照，依照2-ΔΔCt法計算SIRT1 mRNA表達水平。實驗重復3次，下同。

1.4Westernblot測定SIRT1蛋白的表達取3組細胞，以RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。每孔上樣50 μg蛋白，上樣前加入等體積2×Loading buffer煮沸5 min，設置積層膠中90 V電壓電泳，分離膠中120 V電壓電泳，電泳2.5 h。將蛋白在200 mA恒流條件下轉移到PVDF膜上，經體積分數5%牛血清白蛋白室溫封閉120 min后，加1∶600稀釋后的SIRT1抗體于4 ℃條件下孵育10 h，加1∶2 000稀釋后的二抗在室溫中孵育約2 h。用ECL發光試劑盒發光后顯影。以軟件Quantity One分析SIRT1、GAPDH條帶的灰度值，SIRT1蛋白表達水平=SIRT1條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.5MTT檢測細胞增殖3組細胞接種于96孔板(每孔約3 000個細胞)，培養48 h后，添加MTT(每孔20 μL)，37 ℃結合反應3 h。移液槍吸除上清后，每孔添加100 μL DMSO反應10 min，酶標儀測定490 nm的吸光度值，設空白對照組細胞的存活率為100%，分析各組細胞存活率的變化。

1.6PI單染法檢測細胞周期取3組細胞，以胰蛋白酶消化配制成單細胞懸液，用體積分數70%的乙醇固定后，添加PI染液(終濃度為50 mg/L)，300目尼龍網過濾，用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.7AnnexinV-FITC/PI法檢測細胞凋亡取3組細胞，以PBS洗2次，加胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，在細胞中添加400 μL的結合緩沖液，再依次添加Annexin V-FITC、PI各5 μL，用流式細胞儀檢測細胞凋亡，上機檢測前再添加100 μL的結合緩沖液。

1.8Westernblot檢測細胞中CleavedCaspase-3、CHOP、ATF6、CyclinD1、P21蛋白表達水平用Western blot檢測3組細胞中Cleaved Caspase-3、CHOP、ATF6、Cyclin D1、P21蛋白水平(Cleaved Caspase-3一抗按1∶800稀釋，余均按1∶1 000稀釋)，具體步驟同1.4。

1.9統計學處理用SPSS 21.0處理數據，用兩獨立樣本t檢驗比較陰性對照組和干擾組存活率的差異，用單因素方差分析比較3組間其他指標的差異，組間兩兩比較用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組細胞SIRT1表達水平及增殖能力的比較結果見圖1和表1。與空白對照組和陰性對照組相比，感染SIRT1 shRNA慢病毒的細胞(干擾組)SIRT1 mRNA和蛋白表達水平降低，提示成功構建了SIRT1表達下調的子宮內膜癌細胞模型。下調SIRT1后子宮內膜癌細胞的增殖能力降低。

組別SIRT1 mRNASIRT1蛋白存活率/%空白對照組1.00±0.090.45±0.06-陰性對照組0.98±0.120.48±0.09101.45±10.23干擾組0.36±0.04?0.25±0.03?61.52±7.86?F/t74.47511.16727.734P<0.0010.010<0.001

*:與其他2組比較，P<0.05

2.2 3組細胞周期分布及相關因子表達的比較結果見圖2和表2。與空白對照組和陰性對照組相比，干擾組G0/G1期細胞比例升高，S期細胞比例下降，細胞中Cyclin D1蛋白表達水平降低，P21蛋白表達水平升高。

1～3：分別為空白對照組、陰性對照組和干擾組

組別細胞周期/%G0/G1SG2/MCyclin D1P21空白對照組50.51±4.1221.66±5.2327.83±2.480.64±0.090.51±0.07陰性對照組52.18±5.1320.95±4.1626.87±3.200.62±0.080.45±0.08干擾組65.63±4.71?8.36±1.05?26.01±3.640.30±0.06?0.69±0.09?F9.44611.0110.25218.0997.237P0.0140.0100.7850.0030.025

*:與其他2組比較，P<0.05

2.3 3組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達的比較結果見圖3和表3。與空白對照組和陰性對照組相比，干擾組凋亡率升高，細胞中Cleaved Caspase-3、CHOP、ATF6蛋白表達水平升高。

1～3：分別為空白對照組、陰性對照組和干擾組

組別凋亡率/%Cleaved Caspase-3CHOPATF6空白對照組2.10±0.370.28±0.030.32±0.040.26±0.04陰性對照組2.41±0.650.27±0.050.33±0.070.28±0.06干擾組16.59±1.28?0.45±0.06?0.67±0.08?0.39±0.04?F280.59613.15727.6986.485P<0.0010.0060.0010.032

*:與其他2組比較，P<0.05

3 討論

SIRT1是一種依賴輔酶Ⅰ的組蛋白脫乙酰蛋白酶，其可以通過組蛋白H1上的賴氨酸殘基K26、組蛋白H4上賴氨酸殘基K16、組蛋白H3上賴氨酸殘基K9的脫乙酰化對組蛋白進行修飾，能夠調控細胞衰老、神經保護、細胞生長等相關蛋白的表達[7-9]。SIRT1在淋巴瘤、前列腺癌、膀胱癌等腫瘤組織中高表達，并且可以調控多種腫瘤細胞的生長[10-13]。已有研究[14]顯示，SIRT1在子宮內膜癌組織中高表達，可能在子宮內膜癌中發揮癌基因的作用。本實驗表明，下調SIRT1后子宮內膜癌細胞的增殖能力降低，提示下調SIRT1可抑制子宮內膜癌細胞的生長。

細胞周期有序進展是細胞生長的基礎。一個完整的細胞周期是指從上一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結束。G0/G1期向S期進展是細胞周期調控的關鍵點，受細胞內多種蛋白的共同調控，其中Cyclin D1是促進細胞從G0/G1期向S期轉變的關鍵調控因子，其在G0/G1期合成水平升高。而P21可以抑制Cyclin D1蛋白功能，阻礙細胞從G0/G1期向S期進展[15-17]。研究[18-19]顯示，沉默SIRT1可以將前列腺癌、卵巢癌等腫瘤細胞阻滯在G0/G1期。本實驗表明，下調SIRT1后，子宮內膜癌細胞中Cyclin D1蛋白表達水平降低，P21表達水平升高，G0/G1期細胞比例升高，說明下調SIRT1能夠將子宮內膜癌細胞周期阻滯在G0/G1期。

凋亡是重要的細胞生物學特性，受細胞內一系列基因的調控。內質網應激是近年來發現的與細胞凋亡有關的機制，缺氧、氧化應激、藥物等都可以誘導細胞內質網應激，這些刺激因素可以引起內質網胞漿與胞核之間的信號轉導[20]。ATF6是內質網穿膜蛋白，在內質網應激發生時可以迅速被活化，誘導內質網應激元件基因如CHOP等的表達，促進細胞凋亡發生[21]。Caspase-3是Caspase凋亡級聯反應的下游執行因子，以酶原的形式存在于細胞內，只有被活化后才能夠發揮促進細胞凋亡的作用[22]。多個研究[23-24]顯示，SIRT1發揮抗細胞凋亡作用與減輕細胞內質網應激有關，目前在心肌細胞、神經細胞等細胞中已經證實。本實驗表明，下調SIRT1可誘導子宮內膜癌細胞凋亡，促進細胞中ATF6、CHOP表達，誘導細胞中活化的Caspase-3蛋白表達，提示下調SIRT1可以通過內質網應激途徑誘導子宮內膜癌細胞凋亡。

綜上所述，SIRT1可能在子宮內膜癌中發揮癌基因作用，靶向SIRT1可能是治療子宮內膜癌的有效途徑。本實驗未對其具體的靶向調控機制進行研究，后續實驗會在體內和體外進行更深入的探討。