肌萎縮側索硬化癥患者骨骼肌神經末梢中磷酸化TAR DNA結合蛋白43和泛素的表達

周樂波，王雪晶，丁雪冰，姜曉懿，滕軍放

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種進展性、致死性神經系統變性疾病，以錐體束、腦干和脊髓前角中選擇性的運動神經元變性為特征。臨床上較為少見，主要表現為進行性加重的骨骼肌萎縮、無力、肌束顫動、延髓麻痹及錐體束征[1]。ALS發病率約為1.5/10萬，病情進展較快，目前尚無有效的治療手段，患者生存質量較差，預后不良，大部分生存期只有3～5 a[2]。運動神經元及神經膠質細胞中TAR DNA結合蛋白43(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)聚集物(包涵體)是ALS的特異性病理特征，TDP-43包涵體呈泛素(ubiquitin,Ub)陽性，無法正常降解[3]。既往研究[4-7]描述了ALS患者萎縮肌肉的電生理學特點，目前對于ALS患者肌肉組織中異常蛋白聚集物的研究仍較少。為此，該研究通過肌肉活檢術，檢測ALS患者骨骼肌組織及其神經末梢中磷酸化TDP-43(pTDP-43)和Ub的表達情況，探討早期肌肉組織受累在ALS發病中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2012年3月至2018年6月在鄭州大學第一附屬醫院神經內科就診的ALS患者30例， 均符合1999年修訂的Airlie House診斷標準[8]及2008年補充的Awaji-Shima標準[9]，無其他神經系統疾病。22例對照為在該院外科接受手術治療的非神經系統退行性疾病及其他慢性疾病患者。本研究通過鄭州大學及鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，獲得所有受試者和(或)其家屬知情同意并簽署骨骼肌活檢知情同意書。對所有受試者進行全面的病史采集，包括年齡、性別、癥狀、起病部位、病情進展程度、肌電圖、家族史、生活環境、工作性質、吸煙飲酒史、中毒史、外傷史、神經系統病變危險因素接觸史、其他慢性疾病史等。30例ALS患者均經隨訪、體格檢查及神經電生理檢查確診，男19例，女11例；年齡24～80(54.7±13.4)歲，發病至確診時間5～20個月；以單上肢起病者1例，雙上肢3例，單下肢4例，雙下肢5例，四肢8例，偏側肢體2例，以延髓麻痹癥狀起病者3例，延髓麻痹+上肢3例，延髓麻痹+上肢+下肢1例；肌電圖均提示神經源性損害，5例有家族史。22例對照均排除神經系統退行性疾病，男13例，女9例，年齡28～72(48.5±13.0)歲。

1.2肌肉組織取材選取受試者一側上臂，分別于肱二頭肌、肱三頭肌、三角肌對應處用記號筆做好切口標記，碘伏溶液常規消毒，鋪孔巾，20 g/L利多卡因于定位處做逐層浸潤麻醉后，左手固定皮膚，右手持手術刀在擬取材處垂直進刀，沿肌纖維縱行方向分別做約3 cm長的切口，鈍性分離，充分暴露肌肉組織，用血管鉗游離肌束，切取肌束(長0.5～1.0 cm，直徑0.3～0.5 cm)，平均分為兩部分，分別置于40 g/L多聚甲醛中固定及液氮低溫凍存。取材完成后壓迫止血、清理創面、縫合切口、消毒、無菌紗布加壓包扎，8 d后拆線。

1.3肌肉組織HE及酶組織化學染色取出浸泡于40 g/L多聚甲醛內的肌肉組織標本，常規梯度乙醇脫水，經石蠟包埋制成蠟塊，用石蠟切片機連續切片，厚度4 μm。取出低溫凍存的肌肉組織，用冰凍切片機連續切片，厚度15 μm。

1.3.1 HE染色 蘇木精液10 min，流水洗，10 g/L鹽酸乙醇分化10 s；10 g/L伊紅0.5～1.0 min，流水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察肌纖維大小、形態、結構。

1.3.2 ATP酶染色 常規ATP酶染色均在室溫下進行，準備0.01 mol/L巴比妥鈉4 mL、0.18 mol/L氯化鈣4 mL、蒸餾水12 mL；標定酸、堿之后倒入染色小缸，將切片分別放入3種不同pH值(分別為10.40、4.65和4.30)的預孵育液內，室溫下10 min；0.18 mol/L氯化鈣10 min內洗3次，20 g/L氯化鈷3 min，0.01 mol/L 巴比妥鈉洗3次，10 g/L硫化銨30 s，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察肌纖維類型、分布等。

1.3.3 還原型輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶(NADH-TR)染色 配制反應液：將8 mg還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、10 mg硝基四唑氮藍、10 mL 0.2 mol Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)混勻后加入1 mL二甲基亞砜，然后用玻璃棒攪拌2～3 min，過濾后使用。將切片于反應液內37 ℃孵育35 min，丙酮清洗，蒸餾水沖洗，自然干燥，封片。顯微鏡下觀察肌纖維大小、形態、結構及類型、分布等，數碼相機拍照。

1.4神經末梢中pTDP-43和Ub表達的免疫組化檢測石蠟切片烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，H2O2去離子水消除內源性過氧化物酶活性，置于枸櫞酸鈉緩沖液中行高溫高壓抗原修復5 min。胰蛋白酶消化，PBS洗滌，滴加正常山羊血清封閉液，隨后滴加稀釋的一抗工作液(鼠抗pTDP-43抗體購自 Millipore 公司，按1∶300稀釋；鼠抗Ub抗體購自Santa Cruz公司，按1∶500稀釋)，4 ℃ 過夜。室溫下復溫，PBS洗滌3遍。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗工作液(羊抗鼠IgG，購自博奧森公司)，孵育30 min，PBS洗滌3遍。DAB顯色3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察肌細胞形態及著色情況，數碼相機拍照。若胞質和胞核有棕褐色或棕黃色、粗糙顆粒狀著色則記為陽性染色，計算陽性表達率。

1.5統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析，兩組肌肉組織中 pTDP-43和Ub陽性表達率的比較均采用Fisher精確概率法，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1兩組骨骼肌肌肉組織HE及酶組織化學染色結果鏡下可見ALS患者肌肉組織肌纖維大小不等，散在萎縮的小角形纖維，小群萎縮、大組狀萎縮纖維，肌膜核增多，ATP酶染色可見兩型肌纖維萎縮、同型群組化現象，NADH-TR染色可見靶纖維等特征性病理表現；對照組無上述表現(圖1)。

2.2兩組骨骼肌神經末梢中pTDP-43和Ub陽性表達率的比較鏡下可見ALS患者骨骼肌神經末梢中散在分布pTDP-43及Ub陽性染色細胞(圖2、3)。22例對照肌肉組織中未檢出pTDP-43及Ub表達；14例(46.7%)ALS患者pTDP-43陽性表達，18例(60.0%)Ub陽性表達；兩組比較，P均<0.001。

A:ALS組;B:對照組;1:HE染色(×100);2、3:ATP酶染色(×40);4:NADH-TR染色(×100)

A:ALS組;B:對照組;1、2:肌纖維;3、4:骨骼肌神經末梢

A:ALS組;B:對照組

3 討論

ALS是一種累及錐體束、腦干運動神經核及脊髓前角細胞的慢性進行性變性疾病，其病因及發病機制不明。ALS的病理學標志是運動神經元及神經膠質細胞胞質內散在分布的Ub陽性異常束狀蛋白聚集、顆粒樣物質和球狀包涵體，TDP-43是其核心成分[3]。以ALS為代表的TDP-43 蛋白沉積為病理特征的一組疾病統稱為TDP-43蛋白病[10]。Ub陽性包涵體是神經變性疾病的病理特征之一，如阿爾茨海默病的神經纖維纏結、帕金森病的路易小體及亨廷頓病的亨廷頓蛋白包涵體均為Ub免疫反應陽性。在ALS患者的脊髓、腦干、運動皮層的運動神經元及海馬神經元中均分布有Ub陽性包涵體。既往有研究[11]表明，Ub-蛋白酶體系統(Ub-proteasome system, UPS)可能與ALS發病機制有關，UPS異?？蓪е翧LS患者TDP-43蛋白異常聚集。

目前認為，ALS的發病源于運動神經元的損害，繼發產生失神經性肌肉萎縮。電生理學研究[7]證實，ALS患者的肌肉表現為異常的自發活動、運動單位募集減少、運動單位數量減少、傳導速度減慢、復合肌肉動作電位兩側不對稱、慢性重復刺激衰減等。病理組織學研究[6]證實，ALS患者的肌肉組織具有多重病理學改變，包括靶纖維、群組化現象，纖維壞死和炎癥，DNA片段化與促凋亡蛋白的表達等。然而，關于ALS患者肌肉組織中pTDP-43沉積的病理研究較少。有學者[12]對30例ALS患者進行股四頭肌活檢術，未檢測到pTDP-43沉積。另有學者[13]于ALS患者腓腸肌中檢測出Ub結合蛋白P62陽性而pTDP-43陰性的蛋白包涵體。研究[6]發現，33.3%的ALS患者肌肉組織中可檢測出pTDP-43和P62陽性包涵體，尤以軸向骨骼肌(椎旁肌、膈肌)為甚。本研究中作者檢測了ALS患者骨骼肌神經末梢中pTDP-43和Ub的表達情況，結果顯示，46.7%(14/30)的ALS患者三角肌、肱二頭肌、肱三頭肌的神經末梢中pTDP-43陽性表達，60.0%(18/30)的ALS患者Ub陽性表達。本研究中的pTDP-43陽性表達率與以往研究[6]報道的陽性表達率(33.3%)相比稍高，可能與入組病例數較少、檢測肌肉部位不一致以及抗體特異性和靈敏度不一有關。此外，活檢采取受試者的少量肌肉組織樣本，取材的范圍非常有限。

既往研究[4-5]亦證實，ALS轉基因模型鼠的骨骼肌內具有多重病理表現。Atkin等[4]在ALS轉基因模型鼠的腓腸肌、比目魚肌和指長屈肌檢測到可溶性超氧化物歧化酶-1蛋白聚集體。Wong等[5]發現只在骨骼肌中表達人類SOD1-G37R和SOD1-G93A的轉基因小鼠，其神經組織中不表達上述突變蛋白，最終亦可發展成為ALS，致使其運動神經元受累、形成Ub陽性包涵體。上述研究為骨骼肌參與ALS發病這一理論提供了更為直接的證據。

ALS患者骨骼肌神經末梢中pTDP-43包涵體的產生及形成可能有多種機制。首先，可能是由于ALS患者肌細胞及神經纖維自噬-溶酶體系統和UPS損傷，導致TDP-43降解異常。自噬-溶酶體系統和UPS是真核細胞蛋白降解的重要途徑。既往研究[14]表明，TDP-43降解途徑包括自噬-溶酶體系統和UPS。P62是一種多功能Ub結合蛋白，參與自噬-溶酶體系統和UPS兩種蛋白降解過程。Mizuno等[14]在28例ALS患者中觀察到27例前角細胞中具有P62陽性包涵體。王建宇[15]通過對ALS患者骨骼肌標本行透射電鏡觀察，發現萎縮肌纖維內肌節結構紊亂，肌膜下溶酶體、線粒體聚集，可見次級溶酶體和自噬小泡。研究[16]發現ALS轉基因小鼠骨骼肌組織自噬相關標記物表達上調。分析自噬-溶酶體系統可能參與了ALS骨骼肌病變過程，但其作用機制仍待進一步研究。Gilchrist等[17]將野生型Ub(H6Ub)和突變型Ub(H6UbK48R)分別轉入ALS小鼠中，發現表達H6UbK48R的轉基因小鼠的發病延遲，說明Ub的改變可影響ALS的進展。因此，自噬-溶酶體系統和UPS的功能異?？赡軈⑴c了ALS 骨骼肌病變過程。另一可能機制是TDP-43在細胞間朊蛋白樣播散，即通過順軸突轉運。有學者[18]用神經元-神經元跨突觸播散理論來解釋pTDP-43在腦和脊髓中的病理學播散，推測pTDP-43沿著運動神經元的軸突播散至神經肌肉接頭。

綜上所述，該研究結果提示除運動神經元、非運動神經元和神經膠質細胞以外，骨骼肌神經末梢可能是部分ALS患者pTDP-43病理沉積的又一部位。然而目前我國相關研究較少，而且也缺乏較為完整的流行病學資料，因此還需要更大樣本量、部位更廣泛的骨骼肌病理學研究去進一步證實。