過表達E1A激活基因阻遏子對OxLDL誘導的血管內皮細胞損傷的影響

郝曉慧,趙明中，張玉芝，張祖峰，朱秋平，牛方卿

1)鄭州市第九人民醫院心臟中心 鄭州 450053 2)阜外華中心血管病醫院心內科 鄭州 450000

動脈粥樣硬化是一種嚴重的心血管系統疾病，其與2型糖尿病、冠心病等的發生關系密切。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OxLDL)是一種促動脈粥樣硬化發生因子，在動脈粥樣硬化發生時表達升高，具有損傷血管內皮細胞的作用[1-2]。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated gene,CREG)是一種細胞轉錄調控因子，具有抑制細胞增殖和生長的作用，其在分化細胞中表達水平較高，而在去分化的胚胎干細胞、胚胎瘤細胞等細胞中低表達[3]。有研究[4-6]顯示，CREG參與動脈粥樣硬化的發生，在動脈粥樣硬化患者、動物模型動脈粥樣硬化組織中均表達下調；CREG還可以減輕ApoE-小鼠動脈粥樣硬化程度和抑制VP-16誘導的血管內皮細胞凋亡。CREG在OxLDL誘導的血管內皮細胞損傷中的作用目前尚不明確。本實驗觀察了過表達CREG對OxLDL誘導的血管內皮細胞損傷的影響，為研究動脈粥樣硬化血管損傷的發生機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料血管內皮細胞購自北京北納創聯生物技術研究院。pLNCX-CREG重組逆轉錄病毒和對照逆轉錄病毒由湖南豐暉生物科技有限公司構建。OxLDL購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白裂解液購自碧云天生物技術研究所，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，CREG抗體購自美國Santa Cruz公司，Trizol法RNA提取試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，反轉錄試劑盒購自德國Qiagen公司，Real-time PCR試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司，活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平檢測試劑盒購自上海研拓生物科技有限公司，丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量檢測試劑盒購自北京吉美生物技術有限公司，超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司，活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體購自美國CTS公司。

1.2細胞分組取血管內皮細胞接種到24孔板，接種密度為1×106個/L。分為4組，空白對照組不處理；OxLDL組用含100 mg/L OxLDL的細胞培養液培養24 h；另2組分別感染對照逆轉錄病毒(陰性對照組)和pLNCX-CREG重組逆轉錄病毒(pLNCX-CREG組)，用800 mg/L的G418篩選穩定轉染的血管內皮細胞，之后均用含100 mg/L OxLDL的細胞培養液培養24 h。

1.3細胞中CREGmRNA表達的檢測采用Real-time PCR。利用Trizol法RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，-80 ℃保存。反轉錄合成cDNA，步驟參照反轉錄試劑盒說明書。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：CREG上游5’-TACTGAGTCCGCTGCAACAAG-3’，下游5’-ATGAGCCTTGGAAGACCTGTCG-3’；β-actin上游5’-AAGGATTCCTATGTGGGC-3’，下游5’-CATCTCAAGCTCGAAGTC-3’。反應體系：2 μL的cDNA，上、下游引物各0.4 μL，10 μL的SYBR Advantage Premix，0.4 μL的ROX Dye，6.8 μL ddH2O。反應程序：94 ℃反應5 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃10 min，40個循環。依照2-ΔΔCt方法計算CREG表達水平。實驗重復3次，下同。

1.4細胞中CREG蛋白表達的檢測采用Western blot法。取上述各組細胞，添加PMSF/RIPA蛋白裂解液，吹打混合裂解，4 ℃高速離心。吸取上清，用常規BCA法定量檢測，保存于-80 ℃。蛋白樣品上樣量20 μg，電泳后常規方法濕轉膜，將轉膜后的NC膜置于封閉液(10 mL的TBST溶解300 mg脫脂奶粉)中37 ℃反應1.5 h。加入用封閉液按1∶4 000稀釋的CREG一抗，4 ℃條件下過夜反應。加入同法配制按1∶4 000稀釋的HRP標記的二抗，室溫結合1.5 h，ECL顯色試劑盒顯色，采集圖像并分析CREG和內參β-actin條帶的灰度值，二者的比值即為CREG蛋白的表達水平。

1.5細胞培養液中MDA含量、SOD活性及ROS水平檢測取4組細胞，檢測細胞培養液中MDA含量和SOD活性，同時檢測ROS水平，步驟均參照試劑盒說明書。MDA檢測用硫代巴比妥酸法，SOD檢測用黃嘌呤氧化酶法，ROS檢測用DCFH-DA法。

1.6細胞凋亡檢測采用流式細胞術。取4組細胞，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化，每組收集1×106個細胞，用PBS洗滌3次，添加500 μL的Binding Buffer后，再依次添加Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL，混合后孵育15 min。上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7細胞中CleavedCaspase-3蛋白表達水平的檢測取4組細胞，用Western blot法檢測Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平，Cleaved Caspase-3抗體按1∶600稀釋，余步驟同1.4。

1.8統計學處理用SPSS 21.0處理數據。采用單因素方差分析比較4組間以上指標的差異，兩兩比較用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組細胞中CREG表達的比較見圖1、表1。與空白對照組比較，OxLDL組和陰性對照組細胞中CREG mRNA和蛋白的表達水平均降低，而pLNCX-CREG組CREG mRNA和蛋白表達水平均較OxLDL組和陰性對照組升高。

1～4:分別為空白對照組、OxLDL組、陰性對照組、pLNCX-CREG組

圖1 4組細胞中CREG蛋白的表達

*:與空白對照組比較，P<0.05；#:與OxLDL組及陰性對照組比較，P<0.05

2.2 4組細胞培養液中氧化損傷因子水平比較見表2。與空白對照組比較，OxLDL組和陰性對照組SOD活性降低，MDA和ROS水平升高；與OxLDL組及陰性對照組比較，pLNCX-CREG組細胞中SOD活性升高，MDA和ROS水平降低。

表2 4組細胞培養液中氧化損傷因子水平比較(n=3)

*:與空白對照組比較，P<0.05；#:與OxLDL組及陰性對照組比較，P<0.05

2.3 4組細胞凋亡率及CleavedCaspase-3蛋白表達水平比較見圖2、表3。與空白對照組比較，OxLDL組和陰性對照組細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均升高；與OxLDL組及陰性對照組比較，pLNCX-CREG組細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均降低。

1～4：分別為空白對照組、OxLDL組、陰性對照組及pLNCX-CREG組

圖2 4組細胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較

*:與空白對照組比較，P<0.05；#:與OxLDL組及陰性對照組比較，P<0.05

3 討論

動脈粥樣硬化是多數心腦血管疾病發生的基礎，血管內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化發生的機制之一。動脈粥樣硬化發生時，OxLDL等刺激血管內皮細胞致細胞發生過度凋亡和氧化損傷，完整的血管組織受到破壞，最終影響血管正常功能發揮[7-9]。動脈粥樣硬化的危險因素主要有高血壓、糖尿病、肥胖、OxLDL等，其中OxLDL是動脈粥樣硬化發生的必要條件[10-13]。本實驗結果表明，OxLDL處理后血管內皮細胞凋亡率升高，細胞中ROS水平也升高，說明OxLDL能夠誘導血管內皮細胞損傷，提示成功構建了動脈粥樣硬化血管內皮細胞損傷模型。

CREG蛋白含有220個氨基酸，具有3個磷酸化位點，可以通過與不同的配體結合發揮多種生物學功能[14]。研究[15-16]表明，CREG一方面能夠與腺病毒的E1A結合，從而激活下游靶基因，促進細胞增殖；另一方面還能夠與E1A競爭性結合靶基因，從而抑制E1A對靶基因的激活，發揮抑制細胞增殖的作用；CREG同樣可以結合哺乳動物體內的E2F或競爭性地結合靶基因從而發揮增殖促進或抑制作用。近年來的研究[17-18]表明，CREG在動脈粥樣硬化血管中表達下調，并且能夠降低血管內皮細胞凋亡水平，此外，CREG還具有減輕小鼠動脈粥樣硬化的作用。以上研究均表明，CREG可能在動脈粥樣硬化血管損傷中發揮保護作用。本實驗結果顯示，OxLDL處理后的血管內皮細胞CREG表達下調，而感染CREG重組病毒后過表達CREG能夠減輕OxLDL誘導的血管內皮細胞凋亡，這提示過表達CREG能夠抑制OxLDL誘導的血管內皮細胞損傷。氧化應激是動脈粥樣硬化血管內皮細胞損傷的重要機制之一，OxLDL能夠刺激血管內皮細胞中抗氧化酶SOD活性下調，導致細胞內ROS不能被及時清除。ROS可以激活細胞中Caspase凋亡反應，從而誘導細胞凋亡發生；另外，ROS還能夠引起細胞中脂質過氧化反應，產生大量的MDA。因此，細胞中MDA含量、SOD活性及ROS水平可以間接反映細胞氧化損傷程度[19-21]。研究[22]顯示，CREG具有抗氧化應激的作用，其可以減少鹽敏感大鼠冠狀動脈中MDA含量。本實驗結果表明，CREG過表達可以減少OxLDL誘導的血管內皮細胞中ROS和MDA含量，提高SOD活性，減少細胞中活化的Caspase-3蛋白表達，提示過表達CREG具有抗OxLDL誘導的血管內皮細胞氧化損傷的作用。

總之，CREG可降低OxLDL誘導的血管內皮細胞氧化損傷并抑制細胞凋亡，但目前對CREG靶向調控動脈粥樣硬化血管內皮細胞氧化損傷和凋亡的機制尚不明確；本實驗結果為研究動脈粥樣硬化血管損傷提供了參考，為明確CREG在心血管系統疾病中的作用奠定了基礎。