RNAi抑制NOB1表達對肝癌BEL-7402細胞增殖及p38MAPK磷酸化水平的影響

張 斌，劉 岳，林建清，倪亞安，毛盛名

廣州醫科大學附屬第六醫院(清遠市人民醫院)肝膽外科 廣東清遠 511518

肝癌的發生是一個多步驟、多因素引起的復雜病理過程，其受到細胞內多種基因的嚴格調控[1]。研究[2]顯示，腫瘤細胞過度增殖和凋亡減少是肝癌發生及發展的重要原因。Nin1結合蛋白(Nin one binding protein, NOB1)是一種重要的多功能核蛋白，與組織炎癥、細胞凋亡等具有密切關系，參與核糖體40S小亞基組成，在腫瘤的發生和發展中發揮促進作用[3-4]。很多研究顯示，NOB1在腫瘤中高表達，目前已經證實的有膠質瘤[5]、胃癌[6]、肝癌[7]等。在肺癌細胞中的研究[8]表明，下調NOB1表達可以抑制肺癌細胞的增殖并誘導肺癌細胞凋亡。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)在肝癌中活性降低，阻斷其激活可以促進肝癌細胞的增殖[9]。有研究[10]表明，NOB1表達下調可以激活甲狀腺癌細胞中p38MAPK信號通路。本研究觀察了下調NOB1對肝癌細胞增殖、凋亡及p38MAPK磷酸化水平的影響，探討靶向NOB1治療肝癌的可行性，為研究NOB1在腫瘤中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑陰性對照(siRNA-NC)慢病毒和NOB1 siRNA慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司構建包裝，siRNA-NC序列為5’-TTCTC CGAACGTGTCACGT-3’，NOB1 siRNA序列為5’-CCAAGGAAGTGCAATTGCATA-3’;肝癌BEL-7402細胞購自南京科佰生物科技有限公司 ；NOB1、β-actin引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；NOB1抗體、p38MAPK抗體購自上海科順生物科技有限公司；磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)抗體、活化的Caspase-3(C-Caspase-3)抗體購自美國Santa Cruz 公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2細胞分組和慢病毒感染將肝癌BEL-7402細胞接種到24孔板內，每孔1 000個細胞，當細胞融合度達到50%時添加慢病毒顆粒(MOI=10)繼續培養10 h，把培養液更換成含體積分數10%胎牛血清的DMEM，培養2 d后以嘌呤霉素篩選穩定感染的肝癌細胞用于后續研究。肝癌細胞分為空白對照組、siRNA-NC組、NOB1 siRNA組 3組，其中siRNA-NC組、NOB1 siRNA組分別為穩定感染siRNA-NC和NOB1 siRNA慢病毒的肝癌細胞，空白對照組為不做慢病毒感染的肝癌細胞。

1.3qRT-PCR檢測NOB1表達水平在3組細胞中添加1 mL的Trizol裂解液，吹打混合后，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，反轉錄合成cDNA。反轉錄體系：10.0 μL的2×反轉錄緩沖液，1.2 μL的50 nmol的反轉錄引物，2.0 μL的RNA，0.2 μL的MMLV反轉錄酶，加DEPC水至20.0 μL。反轉錄程序：42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min。NOB1 上游引物5’-GAACCGGAGGAAGGAACTCACC-3’，下游引物5’-CCCAGATTTCTCATCTTCCAGTTTG-3’；β-actin 上游引物5’-GGACCTGACTGACTACCTC-3’，下游引物5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3’。PCR反應體系：10.00 μL的2×定量PCR Master Mix，0.08 μL的上、下游引物，2.00 μL的cDNA模板，0.40 μL的Taq DNA聚合酶，2.00 μL的cDNA模板，添加ddH2O至20.00 μL。PCR程序：95 ℃ 180 s；95 ℃12 s，62 ℃ 40 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次。

1.4Westernblot檢測NOB1、p38MAPK、p-p38MAPK、C-Caspase-3表達水平在3組細胞中添加蛋白裂解液，完全裂解后4 ℃高速離心10 min，吸取蛋白上清液，添加Loading Buffer混合，100 ℃反應5 min。配制50 g/L的濃縮膠和100 g/L的分離膠，每孔中添加40 μg的蛋白樣品，電泳2.5 h。把PVDF膜放在轉移緩沖液中浸泡10 min，以30 mA電流進行半干轉移，用50 g/L牛血清白蛋白封閉2 h，再把PVDF膜放在按1∶600稀釋的一抗反應液中室溫反應2 h。將PVDF膜與二抗孵育反應1.5 h后，添加ECL顯色液。用Image J進行灰度值分析，以β-actin作為內參，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.5CCK-8法檢測細胞增殖情況取3組細胞，用細胞培養液將細胞密度調整為5×105個/mL，接種到96孔培養板中，每孔100 μL，放于體積分數5%CO2、37 ℃的培養箱中孵育，分別在培養1、2、3、4 d后取出培養板，吸棄上清液，加入100 μL新鮮培養液和10 μL的CCK-8反應液孵育4 h，在酶標儀上檢測波長450 nm處的吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡情況取3組細胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，1 000×g離心10 min，添加冰預冷后的PBS洗滌3次，與300 μL的Binding Buffer混勻，再添加PI和Annexin V-FITC工作液各5 μL，加入200 μL的Binding Buffer混勻，放在避光條件下孵育15 min，在60 min內用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0進行統計分析。各組間NOB1 mRNA、蛋白相對表達量，A值，凋亡率，C-Caspase-3、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白相對表達量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組細胞NOB1mRNA、蛋白表達水平的比較NOB1 siRNA能夠下調BEL-7402細胞中NOB1的表達，結果見圖1和表1。

2.2 3組細胞A值比較NOB1 siRNA組BEL-7402細胞在450 nm處的A值均降低，見表2。

1：空白對照組；2：siRNA-NC組；3：NOB1 siRNA組

組別nNOB1 mRNANOB1蛋白空白對照組31.00±0.010.68±0.09siRNA-NC組31.01±0.150.67±0.06NOB1 siRNA組30.43±0.06?0.28±0.04?F38.01235.211P<0.001<0.001

*：與空白對照組、siRNA-NC組比較，P<0.05

表2 3組細胞A值比較

*：與空白對照組、siRNA-NC組比較，P<0.05

2.3 3組細胞凋亡率和C-Caspase-3、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達的比較NOB1 siRNA組BEL-7402細胞凋亡率升高，細胞中C-Caspase-3、p-p38MAPK蛋白表達水平升高，見圖2、3和表3。

1：空白對照組；2：siRNA-NC組；3：NOB1 siRNA組

1：空白對照組；2：siRNA-NC組；3：NOB1 siRNA組

組別n凋亡率/%C-Caspase-3p38MAPKp-p38MAPK空白對照組32.16±0.150.10±0.020.92±0.110.25±0.08siRNA-NC組32.17±0.200.11±0.040.90±0.100.27±0.06NOB1 siRNA組316.98±1.40?0.46±0.07?0.91±0.090.48±0.05?F325.56454.8260.03011.688P<0.001<0.0010.9710.009

*：與空白對照組、siRNA-NC組比較，P<0.05

3 討論

NOB1具有多種生物學功能，不僅參與調控20S蛋白酶體的成熟，還是19S核糖體調節亞基的組成部分，參與核糖體40S小亞基的組裝過程[11]，其表達水平的變化可以影響蛋白酶體及核糖體的合成。NOB1在人體的肝臟、脾臟等組織中表達，在結腸、胎盤等組織中低表達，參與人體組織發育和疾病發生[12]。NOB1在卵巢癌組織中的轉錄和蛋白表達水平均明顯高于卵巢良性腫瘤組織和正常卵巢組織，下調NOB1表達可以抑制卵巢癌細胞的增殖能力[13]。在甲狀腺癌[10]、卵巢癌[12]、食管癌[14]等腫瘤組織中均已證實NOB1是一種癌基因，下調其表達可以降低癌細胞的增殖能力。NOB1在肝癌組織中的表達水平高于正常肝組織和肝硬化組織，且NOB1表達水平的高低與腫瘤的大小有關[7]。

增殖和凋亡是細胞重要的生物學特性，是細胞維持內環境穩定的重要途徑之一，細胞惡性增殖、凋亡減少是腫瘤發生的重要原因[15]。Caspase-3是目前公認的細胞凋亡促進因子，其在正常情況下以沒有活性的酶原形式存在，只有活化后才具有誘導細胞凋亡的作用，Caspase-3活化也是細胞凋亡不可逆反應的標志[16]。研究[17-18]表明，下調NOB1可以通過激活Caspase誘導細胞凋亡。本研究結果表明，RNAi下調NOB1表達后的肝癌BEL-7402細胞增殖能力降低，同時細胞凋亡率升高，細胞中Caspase-3活化水平升高，下調NOB1具有抑制肝癌細胞增殖并誘導肝癌細胞凋亡的作用。

p38MAPK蛋白是由360個氨基酸組成的蛋白質，其在人體組織中均有表達，在細胞凋亡、炎性反應、氧化應激等過程中具有關鍵調控作用，參與多種疾病的發生[19]。研究[20]顯示，p38MAPK過度激活抑制腫瘤的發生，p38MAPK在腫瘤組織中磷酸化水平降低，促進其激活后可以逆轉腫瘤細胞過度增殖等惡性表型。p38MAPK不僅參與腫瘤細胞的凋亡過程，還參與NOB1調控腫瘤細胞增殖的過程，在甲狀腺癌的研究[10]中發現，NOB1具有負調控細胞中p38MAPK活化水平的作用。本實驗結果表明，下調NOB1后的肝癌BEL-7402細胞中p38MAPK磷酸化水平升高。

NOB1在肝癌中發揮癌基因的作用，可能是肝癌治療的潛在靶點，下調NOB1具有抑制肝癌細胞增殖并誘導肝癌細胞凋亡的作用，其作用機制可能與激活p38MAPK有關，這證實了NOB1在肝癌細胞中的作用。本實驗沒有對其具體的作用機制進行驗證，在后續實驗中會對上述部分進行深入研究。