上調miRNA-27a-3p對乳腺癌MCF-7細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

蔣雪梅，權 毅

西南醫科大學附屬醫院乳腺外科 四川瀘州 646000

乳腺癌是發生于乳腺腺上皮組織的一種惡性腫瘤，癌細胞極易脫落游離，導致遠端轉移[1]，而肺、骨、腦等全身重要器官的轉移均能直接威脅患者的生命，給乳腺癌的臨床治療增加了極大的困難[2]。近期研究[3-4]顯示，miRNA(miR)-27作為一種癌基因，在多種腫瘤中發揮致癌作用。miR-27在胃癌組織和細胞中呈高表達，能夠通過抑制ZBTB10蛋白的表達促進胃癌細胞的侵襲和轉移[5]。上調miR-27表達能夠促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲[6]。抑制miR-27的表達能夠通過調控Ras/Raf/MEK/ERK信號通路影響食管鱗狀細胞癌細胞的增殖和侵襲[7]。目前研究[8]發現miR-27在乳腺癌組織中異常表達，且在浸潤性乳腺癌中表達顯著上調，提示miR-27可能是乳腺癌進展的重要標志物。因此本實驗通過在人乳腺癌MCF-7細胞中轉染miR-27 模擬物，探究上調miR-27對乳腺癌細胞增殖、侵襲和轉移等惡性生物學行為的影響及其作用的分子機制，以期為乳腺癌的治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑MCF-7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；miR-27a-3p 模擬物及模擬物對照購自廣州銳博生物科技有限公司；實驗所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；Trizol提取試劑盒購自日本TaKaRa公司；反轉錄試劑盒、SYBR Green qRT-PCR Master Mix購自大連寶生物工程有限公司；CCK-8試劑購自上海翊圣生物科技有限公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；Transwell小室購自美國Corning公司；ECL發光試劑盒購自碧云天生物技術研究所；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；PCNA、MMP-2、MMP-9抗體及二抗購自美國CST公司。

1.2細胞分組MCF-7細胞培養在含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基中，置于體積分數5% CO2、95%濕度、37 ℃細胞培養箱中培養，根據細胞生長狀態更換新的培養基。待細胞生長至約70%融合時，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化細胞，進行傳代。取第3代細胞用于后續實驗。取對數生長期的細胞接種于6孔板中，置于37 ℃培養箱中繼續培養，待細胞生長至50%融合時按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書分別轉染miR-27a-3p 模擬物和模擬物對照，分別記為模擬物組和陰性對照組。未進行轉染處理的細胞記為空白對照組。3組MCF-7細胞置于37 ℃培養箱中繼續培養。

1.3qRT-PCR法檢測3組細胞中miR-27a-3p的水平收集轉染48 h后的MCF-7細胞，以Trizol試劑盒提取細胞總RNA，檢測其濃度和純度后，采用反轉錄試劑盒合成cDNA，操作步驟嚴格按照反轉錄試劑盒說明書進行。獲取的cDNA調整濃度后采用SYBR Green qRT-PCR Master Mix進行PCR反應。miR-27a-3p上游引物5’-CACGCAATCTCTCT GGCG-3’，miR-27a-3p下游引物5’-CCAGTG CAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物5’-CTCGT TCGGCAGCACA-3’，U6下游引物5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環；最后72 ℃終延伸10 min。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算細胞中miR-27a-3p的相對表達量。實驗重復3次。

1.4CCK-8實驗檢測3組細胞增殖能力將3組細胞接種于96孔板中，接種密度為1×105個/孔，培養24、48、72、96 h后分別在每孔中加入100 μL的CCK-8試劑，置于37 ℃培養箱中避光孵育30 min。以酶標儀于450 nm波長處檢測細胞的吸光度值(A值)，以A值表示細胞增殖能力。實驗重復3次。

1.5Transwell實驗檢測3組細胞遷移和侵襲能力常規消化細胞，離心并收集，以無血清的DMEM培養基重懸細胞，制成密度為2.5×104個/mL的細胞懸液。取200 μL細胞懸液接種于Transwell小室的上室，在下室中加入800 μL含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃培養箱中培養48 h。取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿透的細胞，以PBS洗滌3次，置于室溫下晾干約10 min，加入100 μL的吉姆薩染液進行染色，于室溫下靜置20 min，然后以PBS洗滌3次，顯微鏡下觀察，每組選取10個視野(×100)，計數穿膜細胞數，以表示細胞遷移能力。實驗重復3次。

將Matrigel基質膠于4 ℃冰箱中融化，然后于冰上將Matrigel膠與DMEM培養基以1∶4體積比混合，以20 μL/孔鋪于Transwell小室的上室，置于37 ℃培養箱中晾干，使用前30 min以無血清培養基清洗上室，吸取培養基后加入200 μL細胞懸液，下室加入800 μL含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃培養48 h。以PBS洗滌3次，除去PBS及懸浮的細胞，晾干，以甲醇固定10 min，結晶紫染色5 min，去離子水沖洗，晾干，倒置顯微鏡(×100)下計數細胞，以表示細胞侵襲能力。實驗重復3次。

1.6Westernblot檢測3組細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白的表達細胞轉染48 h后，除去培養基，以 PBS洗滌3次，加入預冷的裂解液置于冰上充分裂解，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，去上清，以BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白與上樣緩沖液按1∶4體積比混勻，在沸水中加熱10 min，使蛋白變性，以每孔30 μg變性蛋白樣品進行凝膠電泳(100 g/L分離膠、50 g/L濃縮膠)，電泳條件：110 V恒壓電泳2 h。電泳結束后，4 ℃下250 mA恒流轉膜2 h。轉膜結束后，在50 g/L的牛血清蛋白中于室溫下孵育2 h。PCNA(按1∶1 000稀釋)、MMP-2(按1∶800稀釋)、MMP-9(按1∶800稀釋)一抗雜交，4 ℃過夜孵育。二抗(按1∶2 000稀釋)雜交，室溫孵育2 h。ECL顯色，化學發光成像儀曝光，以GAPDH為內參，以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。3組間miR-27a-3p相對表達量，A值，侵襲細胞數，遷移細胞數，PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組細胞中miR-27a-3p的表達水平qRT-PCR檢測結果顯示，空白對照組、陰性對照組、模擬物組MCF-7細胞中miR-27a-3p相對表達量分別為(1.00±0.01)、(1.01±0.01)、(2.76±0.31)(F=95.953，P<0.001)。與兩個對照組比較，模擬物組miR-27a-3p相對表達量升高(P<0.05)。

2.2 3組細胞增殖能力的比較結果見表1。與其他2組比較， 模擬物組MCF-7細胞在24、48、72、96 h時增殖能力均增強。

表1 各組MCF-7細胞A值的比較(n=3)

*：與其他2組比較，P<0.05

2.3 3組細胞侵襲和遷移能力的比較結果見表2。與其他2組比較，模擬物組侵襲和遷移細胞數均增多。

表2 各組MCF-7細胞侵襲和遷移細胞數的比較(n=3)

*：與其他2組比較，P<0.05

2.4 3組細胞中PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的比較結果見圖1和表3。與其他2組比較，模擬物組MCF-7細胞PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均升高。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：模擬物組

組別PCNAMMP-2MMP-9空白對照組0.14±0.020.57±0.040.61±0.05陰性對照組0.13±0.020.54±0.050.59±0.06模擬物組0.75±0.08?1.43±0.08?1.48±0.11?F157.625218.943127.698P<0.001<0.001<0.001

*：與其他2組比較，P<0.05

3 討論

乳腺癌細胞的增殖及轉移給臨床治療造成很大的困難，因此有效抑制乳腺癌細胞的惡性生物學行為成為治療乳腺癌的重要措施[9]。miR是一類廣泛存在的非編碼的小片段核糖核酸分子，具有調控生命活動的功能。目前研究[10-12]顯示，miR在乳腺癌的發生和發展中具有至關重要的作用。研究[13]發現，miR-27在腎癌中通過調控FOXO1的表達發揮致癌作用。胃癌患者外周血中miR-27含量異常升高，且miR-27能夠促進胃癌細胞的轉移和侵襲[14]。miR-27a可影響甲狀腺癌細胞的遷移、侵襲，提示miR-27a可能作為甲狀腺癌的生物標志物[15]。本研究中發現，轉染miR-27a-3p模擬物能夠成功上調MCF-7細胞中miR-27a-3p的表達。上調miR-27a-3p表達后，MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲能力均提高。

miR-27具有調控多種靶基因和信號通路的作用。Wang等[16]的實驗表明，miR-27通過調控Wnt信號通路抑制人骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化。利拉魯肽能夠抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖，且能促進MCF-7細胞凋亡，其機制可能與利拉魯肽下調miR-27a表達有關[17]。本實驗中模擬物組MCF-7細胞中PCNA表達水平顯著升高，說明在乳腺癌MCF-7細胞中miR-27a-3p通過上調PCNA的表達促進細胞增殖。MMP-2和MMP-9屬于MMP家族，其主要功能是維持重塑和降解細胞外基質的動態平衡，參與腫瘤細胞遷移和侵襲過程[18-20]。本實驗結果顯示模擬物組MCF-7細胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平明顯升高，提示miR-27a-3p通過上調MMP-2和MMP-9的表達促進乳腺癌MCF-7細胞的侵襲和遷移。

綜上，上調miR-27a-3p能夠促進乳腺癌MCF-7細胞增殖、侵襲和遷移，其作用機制與促進PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達有關。