顯齒蛇葡萄抗氧化活性與主要成分相關性研究

張命龍，彭密軍*，楊秋玲，王志宏，王 翔

1廣東省測試分析研究所 廣東省分析測試技術公共實驗室，廣州 510070；2廣東中測食品化妝品安全評價中心有限公司，中山 528437

顯齒蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata(Hand.Mazz.)W.T.wang，俗稱茅巖莓、藤茶，主產于湖南、江西、福建等地，系一種資源豐富的類茶植物。2013年由原衛計委批準成為新食品原料。在我國已有700余年的飲用歷史，其味甘淡、性涼，夏天泡茶多日不餿，民間稱之為“神草”。醫藥學專著記載其具有清熱解毒、消脹止渴、治療黃疸肝炎等功效[1]。顯齒蛇葡萄富含多酚、黃酮、鞣質、氨基酸及微量元素，尤其以二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DMY)的高含量而著名，在其幼嫩莖葉部位含量可達15%～30%[2]。藥理學實驗表明顯齒蛇葡萄具有抗氧化、抑菌、消炎、降糖降脂、抗腫瘤等活性[3,4]。

作為典型的藥食兩用型植物，顯齒蛇葡萄抗氧化活性研究一直較為活躍。研究顯示，顯齒蛇葡萄抗氧化活性與黃酮類[5,6]和多酚類[7]可能存在關聯。二氫楊梅素作為一種多酚羥基雙氫黃酮醇，既屬于黃酮類又屬于多酚類化合物，具有較強的抗氧化活性[8]。然而基于現有研究報道，仍難以明確顯齒蛇葡萄抗氧化活性與哪類成分最為相關，以及在不同抗氧化體系下各自的影響程度或貢獻度如何，尚需要具體研究。

顯齒蛇葡萄采用水提工藝，在提取液冷卻或濃縮條件下二氫楊梅素極易析出，難以與其他水溶性成分形成均質體，所以本研究從水提液中通過重結晶分離出二氫楊梅素，制得較高純度的粗品。同時使用兩種醇水體系制備醇提物。獲得四種提取物后，進行抗氧化活性評價，并檢測其中的主要成分總多酚、總黃酮和二氫楊梅素，進而運用SPSS系統進行抗氧化活性與關鍵成分的相關性分析，探究相關程度，同時建立回歸模型，旨在為顯齒蛇葡萄的開發利用提供進一步的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

1.1.1 供試材料

顯齒蛇葡萄產于湖南省張家界，2017年5月采收幼嫩莖葉部位，低溫烘干后保存。

1.1.2 主要試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)購自阿拉丁試劑公司。二氫楊梅素標準品(阿拉丁，純度≥98%)，沒食子酸標準品(中國藥檢院，純度≥95%)，甲醇(色譜級)購自默克公司，水楊酸、鐵氰化鉀購自麥克林公司，福林酚購自國藥集團，聚酰胺樹脂(100～200目)購自臺州市路橋四甲生化廠，乙醇、雙氧水等購自廣州化學試劑廠，超氧陰離子自由基測定試劑購自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要設備

AS20500BT超聲波儀(天津奧特賽恩斯有限公司)，R300旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)，小型噴霧干燥儀(上海那艾精密儀器有限公司)，UV2700紫外-可見光分光度儀(日本島津公司)，LC-20A高效液相色譜儀，配備紫外檢測器(日本島津公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

取干燥顯齒蛇葡萄葉，照文獻方法進行提取[9]。趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮至原體積的1/5，濃縮液于4 ℃冰箱靜置48 h，收集沉淀物，上清液經噴霧干燥得顯齒蛇葡萄水提物(A.grossedentataextract-water,AGE-W)。利用二氫楊梅素易溶于乙醇和熱溶冷析的特性，進行重結晶。沉淀物加入乙醇攪拌溶解，抽濾得澄清液，減壓濃縮除去乙醇，濃縮物再加純水90 ℃加熱30 min，中途不斷攪拌，抽濾去不溶物，濾液4 ℃靜置24 h，收集沉淀，50 ℃真空干燥，得二氫楊梅素提取物(dihydromyricetin extract,DMYE)。

取干燥顯齒蛇葡萄葉，分別以50%乙醇和95%乙醇溶液為溶劑，料液比1∶20，回流提取1.5 h，過濾得濾液，減壓濃縮后，50 ℃真空干燥，獲得兩種不同醇提物：50%顯齒蛇葡萄醇提物(A.grossedentataextract-50%EtOH，AGE-50EtOH)和95%顯齒蛇葡萄醇提物(A.grossedentataextract-95%EtOH，AGE-95EtOH)。

1.3.2 主要成分的測定

1.3.2.1 總多酚

參照文獻方法[10]進行測定。

1.3.2.2 總黃酮

稱各樣品0.1 g，溶解并定容至25 mL。取0.5～1 mL樣液于1 g聚酰胺粉中拌勻，95 ℃水浴揮干，裝入層析柱，先用20 mL苯洗脫雜質，后用甲醇洗脫黃酮組分，收集洗脫液并定容至25 mL。取1 mL洗脫液照文獻方法[11]顯色，測定總黃酮含量。

1.3.2.3 二氫楊梅素

參考文獻方法[2]并略加改動流動相，測定各提取物二氫楊梅素含量。色譜條件：色譜柱TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(25∶75)，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，波長290 nm，進樣量10 μL。

稱取各樣品0.1～ 0.3 g于100 mL容量瓶中，溶解并定容。稀釋10倍，過膜后供HPLC分析。

1.3.3 抗氧化活性實驗

1.3.3.1 羥基自由基(·OH)清除率測定

利用FeSO4與H2O2反應產生·OH，水楊酸分子的苯環結構被·OH攻擊后，產生具有特征吸收的2，3-二羥基苯甲酸，以反應體系的吸光值表示·OH的相對量，吸光值愈大表示·OH愈多[12]。若樣品存在抗·OH成分時，使得·OH與水楊酸反應減弱，相應的產物會減少，以此表示樣品對·OH的清除能力。參考文獻方法[13]測定·OH清除率。每個實驗處理平行3次。·OH清除率R1(%)計算公式如式(1)：

R1= [1-(As-Ab)/A0] × 100%

(1)

式中：A0— 溶劑空白測定的吸光度值；

As— 樣品某濃度下測定的吸光度值；

Ab— 用水代替水楊酸鈉溶液測定吸光度值(扣除樣品本底)。

R2=(A0—As)/A0× 100%

(2)

式中：A0— 溶劑空白測定的吸光度值；

As— 樣品某濃度下測定的吸光度值。

1.3.3.3 DPPH自由基清除率測定

DPPH是一種有機自由基，溶于乙醇后呈現紫色，在517 nm處有最強吸收，當存在自由基清除劑時，DPPH單電子被配對使溶液顏色變淺，吸光值降低，其降低程度與DPPH被清除程度存在定量關系[14]。參照文獻方法[5]測定DPPH清除率。每個實驗處理平行3次。以Vc作為陽性對照。DPPH清除率R3(%)公式如式(3)：

R3= [1-(As-Ab)/A0] × 100%

(3)

1.3.3.4 還原力測定

樣品的抗氧化成分將鐵氰化鉀K3[Fe(CN)6] 還原成亞鐵氰化鉀K4[Fe(CN)6]，亞鐵氰化鉀再與Fe3+反應，生成普魯士藍，以700 nm處反應體系的吸光值表示還原力強度，吸光值愈大，則樣品的還原力愈強[15]。參照文獻[16]并做適當改進，測定還原力。吸取1 mL不同濃度的樣品溶液，加入磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L， pH6.6)2.5 mL,1% K3[Fe(CN)6] 溶液 2.5 mL于試管中混勻，在50 ℃水浴中反應 20 min，取出，流水速冷后加入10 %三氯乙酸2.5 mL，搖勻后靜置10 min,加入純水2.5 mL，0.1 % FeCl31 mL，搖勻，在700 nm處測定吸光值，以此表示還原力大小。以樣品溶劑為空白，以Vc為陽性對照 。

1.4 數據分析

所有數據以平均值±標準誤表示。用統計分析軟件SPSS 19.0對數據進行方差分析(LSD法)、Pearson相關性分析和回歸分析。

2 結果與分析

2.1 主要成分含量

由表1可知四種提取物中總黃酮、總多酚及二氫楊梅素含量差異明顯。AGE-W中該三種成分含量均為最低，醇提物居中，DMYE中含量最高。對比AGE-W、AGE-50EtOH和AGE-95EtOH可發現，顯齒蛇葡萄中的黃酮、多酚及二氫楊梅素更易溶解在乙醇濃度高的溶劑中，這證實了它們較好的醇溶性[9]。各提取物中二氫楊梅素為多酚和黃酮的重疊部分，除此之外，可能還含有沒食子酸、沒食子酰葡萄糖[17]等多酚類成分，含量約占4%～16%；以及楊梅素、槲皮素、蘆丁、木犀草素等黃酮類成分[1,18]，含量約占12%～20%。同時兩種醇提物中總黃酮含量明顯高于總多酚，表明顯齒蛇葡萄中黃酮類物質總量多于多酚類，這與文獻報道[19]相符。由多酚和黃酮的結構推測，顯齒蛇葡萄中可能存在一定量的非多酚類黃酮組分。

表1 不同顯齒蛇葡萄提取物主要活性成分含量(n=3，%)

注：與AGE-W相比，**在P< 0.01水平，有顯著差異。

Note：compared with AGE-W,**significant difference atP<0.01.

圖1 二氫楊梅素標準品(a)、AGE-W(b)、AGE-50EtOH(c)、AGE-95EtOH(d)、DMYE(e)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC Chromatogram of DMY standard(a),AGE-W(b),AGE-50EtOH(c),AGE-95EtOH(d)and DMYE(e)

2.2 抗氧化活性

2.2.1 羥基自由基(·OH)清除活性

羥基自由基(·OH)是細胞代謝過程中產生的生理自由基，化學性質活潑，容易攻擊蛋白質，核酸和脂質等大分子物質，從而損傷細胞的正常功能[20]。圖2為不同顯齒蛇葡萄提取物對·OH的清除效果。由圖2可知，四種提取物對·OH均具有強烈清除作用，且呈現量效正相關，其中DMYE的清除效果最強，AGE-50EtOH和AGE-95EtOH較接近，AGE-W相對較弱。通過計算IC50可知四種提取物的·OH清除活性強弱順序為DMYE(IC50值10.29 μg/mL)、AGE-50EtOH(24.62 μg/mL)、AGE-95EtOH(40.60 μg/mL)、AGE-W(140.31 μg/mL)，而對照樣Vc的IC50為76.54 μg/mL。這表明顯齒蛇葡萄醇提物清除·OH活性優于水提物，且優于Vc。

圖2 不同提取物對羥基自由基(·OH)的清除效果Fig.2 Effect on ·OH scavenging of different extracts

圖3 不同提取物對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.3 Effect on scavenging of different extracts

2.2.3 DPPH清除活性

DPPH是一種較穩定的有機自由基。圖4為不同顯齒蛇葡萄提取物對DPPH的清除效果。由圖4可知，四種提取物對DPPH均有顯著清除作用，呈現明顯的量效正相關。其中DMYE、AGE-50EtOH和AGE-95EtOH的最大清除率約為85%，AGE-W最大清除率約50%。表明顯齒蛇葡萄醇提物DPPH清除活性強于水提物。通過計算IC50可知4種提取物DPPH清除活性強弱順序為DMYE(IC50=6.17 μg/mL)、AGE-95EtOH(8.20 μg/mL)、AGE-50EtOH(9.27 μg/mL)、AGE-W(20.89 μg/mL)，而對照樣Vc的IC50為17.93 μg/mL。這提示顯齒蛇葡萄醇提物DPPH清除活性優于水提物，且優于Vc。

圖4 不同提取物對DPPH的清除效果Fig.4 Effect on DPPH scavenging of different extracts

2.2.4 還原力

還原力測定用來檢驗樣品中抗氧化成分的電子供應，通過還原作用給出電子，清除自由基，還原力越強，抗氧化性越強，因此可作為抗氧化性能的指標。圖5為不同顯齒蛇葡萄提取物還原力測試結果。由圖5可知，四種提取物具有較強的還原能力，呈現良好的量效正相關。在實驗濃度范圍內，隨著作用濃度增大，還原力幾乎與之呈現線性正相關。總體上，DMYE還原力最強，與Vc相當，AGE-95EtOH還原力略強于AGE-50EtOH，AGE-W相對較弱。由此表明，不同顯齒蛇葡萄提取物均具有抗氧化性能。

圖5 不同提取物的還原力Fig.5 Reducing power of different extracts

2.3 相關性分析

2.3.1 Pearson相關分析

2.3.2 回歸模型分析

回歸分析側重考察變量之間的數量變化規律，并通過一定的數學模型來表征這種關系，進而確定一個或幾個變量的變化對另一個變量的影響程度。根據2.3.1的相關性分析結果選擇與抗氧化活性相

表2 抗氧化活性與主要成分的Pearson相關分析結果

注：* *表示在P<0.01水平呈現顯著相關，下同。

Note：* *mean significantly relevant atP<0.01,the same as below.

關系數最大的成分運用SPSS進行多模型曲線擬合，建立回歸方程，見表3及圖6～9。由表3可知，對于·OH清除活性，對數曲線的決定系數R2最高，且有顯著性意義，故選擇曲線模型建立回歸方程，由SPSS分析結果得到回歸方程為Y= 0.212+0.101lnX，其中X為顯齒蛇葡萄提取物中二氫楊梅素濃度(μg/mL)，Y為該提取物對·OH的清除率。

對于DPPH清除活性，二次和三次曲線的決定系數R2最高，且有顯著性意義，故選擇二次模型建立回歸方程，回歸方程為Y=0.263+0.025X+0.002X2，其中X為顯齒蛇葡萄提取物中總多酚濃度(μg/mL)，Y為該提取物對DPPH清除率。

對于還原力，同樣是二次和三次曲線的決定系數R2最高，且有顯著性意義，故選擇二次模型建立回歸方程，回歸方程Y=0.022 + 0.01X-2.03×10-5X2，其中X為顯齒蛇葡萄中總多酚濃度，Y為還原力大小。

表3 抗氧化活性實驗的多模型擬合效果

圖6 ·OH清除率與二氫楊梅素的曲線擬合圖Fig.6 Fitting curve between ·OH scavenging rate and dihydromyricetin

圖 清除率與總黃酮的曲線擬合圖Fig.7 Fitting curve between scavenging rate and total flavonoids

3 結語

本文制備了四種提取物，確定總多酚、總黃酮及二氫楊梅素為考察因素，探究顯齒蛇葡萄提取物抗氧化活性與它們的相關程度，并建立回歸方程模型。四種提取物中AGE-W的總多酚、總黃酮和二氫楊梅素含量均最低，醇提物居中，DMYE中最高。這表明總多酚和總黃酮的醇溶性優于水溶性。AGE-50EtOH、AGE-95EtOH、DMYE提取物中該三種成分含量之和大于100%，這提示它們之間可能存在重疊組分。同時推測顯齒蛇葡萄中可能存在一定量的非多酚類黃酮組分。

圖8 DPPH清除率與總多酚的曲線擬合圖Fig.8 Fitting curve between DPPH scavenging rate and total polyphenols

圖9 還原力與總多酚的曲線擬合圖Fig.9 Fitting curve between reducing power and total polyphenols

當前顯齒蛇葡萄開發的產品有植物飲料、保健品(如拙牌清純片)及藥品(如顯齒蛇葡萄總黃酮含片)。在進行產品開發過程中，大多采用水提或醇提工藝。極少使用其它有機試劑進行提取。本研究基于此現狀，利用水或乙醇為溶劑，提取制備了四種不同的提取物，系統地考察它們的抗氧化活性，并分析其中的主要抗氧化成分。然而，多酚和黃酮的種類繁多、結構復雜，抗氧化活性的作用機制尚有待進一步闡明。