鈍裂銀蓮花主要色素成分及適應(yīng)機(jī)制的研究

呂婉靈，劉左軍，張小瑞，王玉賢

蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730050

鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)為毛茛科(Ranunculaceae)銀蓮花屬(Anemone L.)中的一種多年生草本植物，單花頂生，一般產(chǎn)生1～3個(gè)獨(dú)立花莖，花色有黃色、淺黃色和白色3種[1]。主要生長(zhǎng)在海拔2900～4000 m的高山草地或鐵杉林下。分布區(qū)內(nèi)年平均降水量534 mm，年平均溫度為1.6 ℃，從植物區(qū)系組成和水熱特征來看，屬于典型的高寒草甸[2]。目前，對(duì)鈍裂銀蓮花的研究主要集中在它的藥用價(jià)值、交配系統(tǒng)特征和花期資源分配[3]，以及在不同海拔條件下鈍裂銀蓮花的繁殖分配和繁育系統(tǒng)[4]等方面，對(duì)其花色素方面的研究幾乎未見報(bào)道。在寒冷的高原地區(qū)，鈍裂銀蓮花有其自身的適應(yīng)機(jī)制。近年來高原地區(qū)環(huán)境變化顯著，鈍裂銀蓮花出現(xiàn)了明顯的白色花減少，以及淺黃色、黃色花花增多的現(xiàn)象，猜想這一現(xiàn)象可能與其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性與生物進(jìn)化有關(guān)。植物的花色素主要有類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿三種[5]，類黃酮又分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮和花色苷，黃酮和黃酮醇呈現(xiàn)黃色和無色，花色苷控制紅、藍(lán)和紫等顏色，可以分為三種：花葵素、飛燕草素和花青素，它們一般在同種花中單獨(dú)存在；類胡蘿卜素包括胡蘿卜素和葉黃素，呈現(xiàn)黃色、橙色、紅色和紫色；生物堿是甜菜堿、小檗堿、罌粟堿等的統(tǒng)稱，甜菜堿呈無色，罌粟堿呈黃色，小檗堿呈深橙色或黃色。而含有花色素的花都不含有生物堿[6]，薛德艷[7]等已成功提取鈍裂銀蓮花的類黃酮和類胡蘿卜素，所以本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)分析這兩類色素。故本研究通過高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用分析黃色、淺黃色和白色的鈍裂銀蓮花花色素成分及含量，確定其導(dǎo)致花色不同的主要色素，進(jìn)一步分析合成該色素的關(guān)鍵酶。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為甘肅省合作(103°22′ E，35°18′ N)的白色、淺黃色、黃色鈍裂銀蓮花，于七月上旬采其盛花期花瓣，去除花蕊，沖洗干凈，80 ℃殺青30 min，然后 60 ℃烘干粉碎成末，裝于自封袋避光干燥保存。

1.2 紫外-可見分光光度計(jì)光譜分析

1.2.1 類黃酮光譜分析

分別稱取0.1 g各色干花瓣，加入5 mL甲醇一甲酸(98∶2，v/v)抽提溶劑，黑暗條件下浸提24 h，過濾，收集慮液，濾渣分次加人3 mL，2 mL抽提液，進(jìn)行第2、3次的抽提，合并收集的慮液，定容至10 mL。用 UV-3000 型紫外-分光光度計(jì)在 200～700 nm內(nèi)進(jìn)行掃描，比色皿光徑1 cm。

1.2.2 類胡蘿卜素光譜分析

分別稱取0.1 g干花瓣，加入5 mL丙酮：乙醇(石油醚)1∶1的混合溶液，避光浸提24 h，過濾，再加入5 mL浸提，合并濾液，定容至10 mL。用 UV-3000 型紫外-分光光度計(jì)在 200～700 nm內(nèi)進(jìn)行掃描，比色皿光徑1 cm。

1.3 花色素定性定量分析

類黃酮樣品制備：取0.1 g干花瓣，加入5 mL甲醇一甲酸(98∶2，v/v)抽提溶劑，于4 ℃冰箱避光浸提24 h，取上清液用濾紙粗濾后,經(jīng)微孔濾膜(脂溶性0.45 μm)過濾。標(biāo)準(zhǔn)品：槲皮素、山奈酚、木犀草素、蘆丁購(gòu)于上海源葉生物科技公司。

采用Waters 2685型高效液相色譜儀，Agilent 6460 LC/MS型液質(zhì)聯(lián)用儀，Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。色譜條件：流動(dòng)相組成：A相0.1%磷酸一水溶液；B相乙腈溶液,洗脫程序如下：0 min，1%B；15 min，8%B；35 min，22%B；45 min，42%B；55 min，75%B；65 min，100%B。流速0.2 mL/min； 柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm，PAD掃描波長(zhǎng)范圍190～650 nm。

液質(zhì)條件：色譜條件同上，質(zhì)譜條件：離子化方式:電噴霧離子源(ESI)，正離子(PI)、負(fù)離子(NI)方式;電噴霧離子源參數(shù)：噴霧電壓：70 V～250 V；掃描區(qū)間:m/z100～1 000；氮?dú)饬魉?.0 L/min，溫度350 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-可見分光光度計(jì)光譜分析

2.1.1 類黃酮光譜分析

由鈍裂銀蓮花類黃酮提取液的紫外-可見光光譜分析(圖1)可知，在268 nm和330 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，符合類黃酮的特征吸收峰。240～285 nm(峰帶Ⅱ)為主峰較明顯，300～350 nm(峰帶Ⅰ)較弱，A-環(huán)苯甲酰系統(tǒng)(峰帶Ⅱ)和B-環(huán)桂皮酰系統(tǒng)(峰帶Ⅰ)均含有[8]，A-環(huán)苯甲酰系統(tǒng)濃度較大。而隨著花色加深，類黃酮吸收峰逐漸增大，總含量隨花色深淺變化規(guī)律性變化(圖2)，白色較淺黃色最大吸光值分別下降64.03%(268 nm)和67.02%(330 nm),淺黃色較黃色最大吸光值分別下降35.44%(268 nm)和34.78%(330 nm)。

圖1 花色素紫外-可見分光光譜分析Fig.1 The UV-visible spectra of petal pigments in Anemone obtusiloba

2.1.2 類胡蘿卜素光譜分析

由鈍裂銀蓮花類胡蘿卜素提取液的紫外-可見光光譜分析(圖1)可知，在268 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，符合類胡蘿卜素的特征吸收峰,。隨花色加深，類胡蘿卜素吸收峰逐漸增大，總含量隨花色深淺變化規(guī)律性變化(圖2)，白色較淺黃色最大吸光值下降28.19%，淺黃色較黃色最大吸光值下降24.34%。

圖2 不同花色花色素的吸光度比較Fig.2 Comparison of petal pigments absorbance of different flower color

類黃酮和類胡蘿卜素的總吸光度均隨花色變淺而下降，但類黃酮的下降趨勢(shì)較類胡蘿卜素的更明顯(趨勢(shì)線斜率更大)，且總含量更高(圖2)，故類黃酮總含量變化更明顯，所以把類黃酮作為鈍裂銀蓮花花色變化的主要花色素定性定量分析 。

2.2 花色素定性定量分析

經(jīng)過對(duì)類黃酮提取物進(jìn)行HPLC-PAD分析，鈍裂銀蓮花的不同花色在300 nm波長(zhǎng)處均可檢測(cè)到7種化合物，且出峰時(shí)間基本一致，表明三種花色所含類黃酮種類一致，根據(jù)文獻(xiàn)[9]推測(cè)其花色的差異性不是由色素種類的不同引起的，而是由某種色素的含量變化導(dǎo)致的(圖3)。根據(jù)其不同花色同一峰的吸光度變化分析，吸光度的總變化趨勢(shì)均為隨花色變淺而減小，而峰1、2、5、6的化合物在相同花色的吸光度中也隨花色變淺而減小，推測(cè)其可能是主要色素。

為了進(jìn)一步確定具體的色素種類，選取總含量較高的樣本進(jìn)行HPLC-MS分析。故選用黃色花的類黃酮提取物進(jìn)行定性分析。

圖3 黃色(A)、淺色(B)和白色(C)鈍裂銀蓮花類黃酮的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of flavonids from Anemone obtusiloba yellow(A),pale yellow(B) and white(C)

黃色花類黃酮樣品和4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC-MS分析，得到圖4、圖5的總離子流圖和圖6的樣品陽離子質(zhì)譜圖，結(jié)合圖3，與相關(guān)參考文獻(xiàn)比較，得出表1的分析結(jié)果。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素(1)、山奈酚(2)、木犀草素(3)和蘆丁(4)的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of standards lquercetin(1),kaempherol(2),luteolin(3) and quercetin-3-O-rutinoside(4)

圖5 黃色花類黃酮的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of flavonid from yellow flower

由圖5、圖6可知，峰7的 [M+H]+為m/z645.18，碎片離子m/z465為失去一分子葡萄糖所得，再脫去一分子葡萄糖得碎片m/z287，為木犀草素苷元，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道相符合，推測(cè)其為木犀草素-3-7-O-葡萄糖苷。峰1、2、3、6的MS2中都有與槲皮素苷元相符的m/z303及其裂解的m/z274碎片，推測(cè)其為槲皮素的衍生物。6號(hào)峰的 [M]+為m/z625.15，含有碎片離子465和303，說明脫去兩分子六碳糖，與文獻(xiàn)[11,12]中槲皮素-3-O-蕓香糖苷碎片一致。峰3、2的 [M+H]+均為m/z465.1，脫去一分子六碳糖得m/z303，根據(jù)文獻(xiàn)[15,18]半乳糖苷極性較大，推測(cè)峰3為槲皮素-3-O-半乳糖苷，峰2為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。峰1的 [M+H]+為m/z449.2，其碎片離子m/z303為脫去一分子鼠李糖，糖基離子為m/z146，與文獻(xiàn)[14,17]報(bào)道槲皮素-3-O-鼠李糖苷一致。5號(hào)峰[M+H]+為m/z611.2，碎片離子m/z287與山奈酚符合，推測(cè)其結(jié)構(gòu)中含有山奈酚，碎片m/z445說明失去兩分子葡萄糖，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的山奈酚-3-O-槐糖苷一致。 峰4的 [M+3H]+為m/z483.1，含有楊梅黃素的特征離子m/z318，糖基離子為m/z146，與文獻(xiàn)[13,14]的楊梅黃素-3-O-鼠李糖相符合。

圖6 樣品的陽離子質(zhì)譜圖Fig.6 Cationic mass spectrograms of sample

根據(jù)對(duì)各化合物的推測(cè)結(jié)果及圖3的吸光度變化，可以看出槲皮素的糖類衍生物含量占比較大，吸光度隨花色變化較明顯。

表1 鈍裂銀蓮花黃色花類黃酮HPLC-MS分析結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過紫外-可見光譜掃描法，HPLC-PAD和HPLC-MS的方法，分析鈍裂銀蓮花花色差異的主要色素及其關(guān)鍵酶。通過對(duì)類黃酮的紫外-可見光譜分析，根據(jù)譜帶Ⅱ和譜帶Ⅰ的位置推測(cè)，可能含黃酮及其醇類和異黃酮化合物，不含有二氫黃酮及其醇類、橙酮、查爾酮。HPLC-MS測(cè)定了類黃酮中的7種色素：木犀草素-3-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、楊梅黃素-3-O-鼠李糖、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷，與紫外-可見光譜結(jié)果推測(cè)一致。由定性定量結(jié)果推測(cè)槲皮素的衍生物是導(dǎo)致鈍裂銀蓮花花色差異的主要色素，根據(jù)類黃酮代謝途徑[19]可以確定合成該色素的酶—類黃酮3′-羥化酶(flavonoid3′-hydroxylase F3′H)是影響槲皮素含量增加的關(guān)鍵酶。

鈍裂銀蓮花生長(zhǎng)在環(huán)境惡劣的高寒地區(qū)，近年來環(huán)境變化顯著，其白色花逐漸減少，通過本實(shí)驗(yàn)，確定了調(diào)控其花色深淺的關(guān)鍵酶，推測(cè)其花色適應(yīng)環(huán)境的生物機(jī)制是通過調(diào)控黃酮醇合成酶來影響槲皮素的含量，進(jìn)而影響槲皮素衍生物的含量，以達(dá)到改變花色深淺適應(yīng)環(huán)境的目的。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究鈍裂銀蓮花的進(jìn)化機(jī)制提供了有力的數(shù)據(jù)參考，對(duì)其花色的研究有比較有意義的價(jià)值。