姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞氧化損傷的保護作用及機制研究

鐘 宇，黃瓊林，莫明明，楊青錦，蔡 春

廣東醫科大學分析中心， 湛江 524023

氧化應激是自由基在體內產生的一種負面作用，自由基又稱游離基，是具有非偶電子的基團或原子。自由基的產生與清除，處于動態平衡中，產生的自由基量很少時，在體內可以調節細胞生長、基因表達、殺菌、調節血管舒縮狀態，從而發揮重要的生理功能。然而自由基的產生與清除之間的平衡被打破，在人體內積累到一定量時，很容易與鄰近細胞發生化學反應，使細胞結構受到破壞，造成細胞功能喪失、 基因突變、甚至死亡，最終引起氧化損傷相關疾病，如老年性癡呆、帕金森病、腫瘤及炎癥等。研究發現氧化應激是炎癥反應的一個重要病理過[1,2]，氧化應激失衡在潰瘍性結腸炎(UC)的發病及病理進程中發揮著至 關重要的作用[3-5],過度激活的氧化應激反應引起氧自由基大量表達，造成結腸組織細胞代謝障礙，腸黏膜屏障功能受損，最終導致腸道組織的慢性炎癥反應[6,7]。

近年來，從天然藥物中探尋具有清除自由基活性的高效低毒的天然抗氧化劑用于保護細胞免受氧化損傷成為研究熱點[8]。姜黃素(curcumin)是一種相對分子質量低的多酚類化合物，主要來源于姜科植物郁金塊根、姜黃根莖、 莪術根莖和天南星科植物菖蒲根莖等。具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凝、抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化等廣泛的藥理活性，且毒性低、不良反應小[9-11]。研究發現多種疾病的發生與自由基形成、炎癥反應的參與有關，姜黃素抗氧化活性和抗炎作用已引起國內外學者的廣泛關注。本研究利用H2O2誘導人HT29細胞氧化應激損傷模型，探討姜黃素對HT29細胞的保護作用及其相關分子機制，以期為姜黃素的藥理藥效及臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞

HT29(人結腸癌細胞)購自美國ATCC公司。

1.2 試劑與儀器

RPMI-1640 培養基、0.25% EDTA-胰酶、抗青霉素/鏈霉素溶液、胎牛血清(美國Gibco公司)； MTT粉劑(美國Sigma公司)； FITC Annexin V Apoptisis Detection Kit、Cycletest Plus DNA Reagent kit(美國BD公司)； caspase-3活性檢測試劑盒、caspase-9活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、活性氧檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF(碧云天生物技術有限公司)；姜黃素標準品(上海源葉生物有限公司HPLC ≥98%)。酶標儀(瑞士Tecan公司)；流式細胞分析儀(美國BD公司)；化學發光成像儀(上海天能科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

HT29細胞培養于含10% FBS、1%青鏈酶素雙抗的RPMI-1640培養基中，37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養，2天傳代1次。實驗時將細胞接種于培養板中，待細胞進入對數生長期進行實驗。

1.3.2 細胞用藥配制

稱取適量姜黃素，溶于DMSO配成100 mmol/L的儲存液，并通過0.22 μm膜過濾除菌，使用前，用含10% FBS的RPMI-1640培養液配成不同濃度的工作液。

1.3.3 細胞損傷模型的建立

取對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/mL，按100 μL/孔接種于 96孔板中，放置于37 ℃、5%的CO2培養箱培養24 h。細胞貼壁，匯合度達到80%～90%，棄去培養基，加入用培養液稀釋不同濃度的H2O2(0、25、50、100、200、 400、800、1 600 μmol/L)， 設置空白組，空白組加入相同體積的培養液，每組設6個平行孔。 培養4，8，12，24 h后，每孔加 MTT(5 mg/mL)10 μL，置于37 ℃、5%的CO2孵箱中培養4 h后，每孔加100 μL的DMSO，震蕩10 min，用酶標儀在490 nm處測定每孔OD值，計算細胞抑制率。

1.3.4 姜黃素給藥劑量范圍的確定

細胞鋪板同上，置于37 ℃、5% 的CO2培養箱培養24 h。給予不同濃度的姜黃素(0、2.5、5、10、25、50、100、200 μmol/L)，同時設DMSO組與空白組，DMSO組加入含0.1% DMSO的培養液培養細胞，空白組加入相同體積的培養液，每組設6個平行孔，繼續培養24 h。MTT法檢測不同濃度姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞活力的影響。

1.3.5 姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞氧化損傷保護作用研究的細胞分組及藥物處理

取實驗待用細胞分組為：①正常組(Control)：加入完全培養基；②模型組(H2O2)：加入終濃度為800 μmol/L的H2O2處理細胞 24 h；③姜黃素低劑量組(Cur-1)、中劑量組(Cur-2)、高劑量組(Cur-3)：細胞貼壁后，終濃度分別為2.5、5、10 μmol/L姜黃素預處理6 h后,再加入終濃度為800 μmol/L的H2O2，作用24 h。

1.3.6 姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞毒性的影響

細胞接種于96孔板中，放置于37 ℃、5% 的CO2培養箱培養24 h。細胞分組及藥物處理同“1.3.5”，MTT法檢測姜黃素對H2O2誘導HT29細胞毒性的影響。

1.3.7 Annexin/PI雙標記法檢測HT29細胞凋亡

細胞接種于6孔板中，細胞分組及藥物處理同“1.3.5”。收集細胞和上清液，用PBS輕洗2次；1 000 rpm 離心 5 min， 棄上清，加入適量1×Binding Buffer重懸細胞，使細胞密度大約為1×106個/mL。加入5 μL Annexin V-FITC避光染色15 min，再加入5 μL PI于室溫下避光孵育5 min；流式細胞儀檢測熒光強度。

1.3.8 PI染色分析HT29細胞周期

細胞接種于6孔板中，細胞分組及藥物處理同“1.3.5”。收集細胞，預冷的70%乙醇固定， 4 ℃過夜。棄去乙醇， PBS清洗2次，加入0.5 mL含10 μL碘化丙啶及10 μL RNase的染色緩沖液懸浮細胞，避光孵育30 min，流式細胞儀檢測。

1.3.9 細胞內ROS和線粒體膜電位檢測

細胞接種于6孔板中，細胞分組及藥物處理同“1.3.5”。收集細胞，按試劑盒說明書步驟操作，流式細胞儀檢測細胞內ROS水平和線粒體膜電位。

1.3.10 LDH漏出量的檢測

細胞接種于96孔板中，細胞分組及藥物處理同“1.3.5”，設空白對照孔，孵育結束，取各孔上清120 μL 至新的96孔板中，加60 μL配好的LDH檢測工作液，室溫避光孵育30 min后，用酶標儀在490 nm處測定OD值，按照試劑說明書計算酶釋放量百分數。

1.3.11 細胞內SOD，MDA水平和caspase-3，caspase-9酶活性的檢測

細胞接種于6孔板中，細胞分組及藥物處理同“1.3.5”。收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，裂解細胞，離心取上清液，另取少量樣品上清用Bradford法測定蛋白濃度，按試劑盒說明書操作，酶標儀檢測細胞內SOD，MDA水平和caspase-3，caspase-9活性。

1.3.12 統計學分析

2 結果

2.1 細胞損傷模型的建立

如圖1所示，與正常對照組比較，H2O2終濃度為800 μmol/L，作用時間4、8、12、24 h細胞抑制率分別為22.91%、26.12%、30.30%、36.64%。確定H2O2誘導細胞損傷的終濃度為800 μmol/L，作用時間為24 h。

圖1 MTT 法檢測H2O2對HT29細胞活力的影響Fig.1 Effect of H2O2 on cell viability in HT29 cells

圖2 MTT法檢測姜黃素對HT29細胞活性的影響Fig.2 Effect of curcumin on cell viability in HT29 cells by MTT 注：與對照組比較，**P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01.

2.2 姜黃素對HT29細胞活力的影響

在正常細胞中，給予不同濃度的姜黃素(0、2.5、5、10、25、50、100、200 μmol/L)單獨作用細胞24 h。MTT結果表明，與不加姜黃素的正常對照組比，姜黃素在2.5～10 μmol/L范圍內對細胞無毒性；此外，0.1% DMSO對細胞也無毒性(圖 2)。

圖3 姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞活性的影響Fig.3 Effect of curcumin on cell death in H2O2-induced HT29 注：與對照組比較，**P<0.01；與 H2O2 組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01；compared with the H2O2 group,#P<0.05,##P<0.01.

2.3 姜黃素對H2O2損傷HT29細胞活力的影響

與正常對照組相比，H2O2模型組細胞活力顯著降低(P<0.01)，姜黃素組(2.5、5、10 μmol/L)細胞活力明顯高于H2O2模型組(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴關系(圖 3)。

2.4 姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示(圖4)，H2O2模型組細胞凋亡率較正常對照組顯著增加(P<0.01)；姜黃素組(2.5、5、10 μmol/L)細胞凋亡率顯著低于H2O2模型組(P<0.01)，并呈劑量依賴性抑制凋亡的增加。

2.5 姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞周期的影響

與對照組比較(圖5)，H2O2模型組G0/G1期所占百分比例顯著升高(P<0.01)， S期所占百分比例顯著降低(P<0.01)；與H2O2模型組相比，姜黃素組(2.5、5、10 μmol/L)G0/G1期所占百分比例明顯減少(P<0.01，P<0.05)，S期所占百分比例明顯增加(P<0.01，P<0.05)。

圖4 姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞凋亡的影響Fig.4 Effect curcumin on apoptosis in H2O2-induced HT29 注：與對照組比較，**P<0.01；與 H2O2 組比較，# P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01;compared with the H2O2 group,##P<0.01.

2.6 姜黃素對H2O2導致的胞內ROS水平和線粒體膜電位的影響

如圖6所示，與正常對照組比較，H2O2模型組 ROS水平顯著增高(P<0.01)，線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)；與H2O2模型組比較，姜黃素組(2.5、5、10 μmol/L)劑量依賴性抑制H2O2導致的胞內ROS水平升高(P<0.01，P<0.05)，線粒體膜電位劑量依賴性升高(P<0.01)。

2.7 姜黃素對H2O2損傷HT29細胞內LDH漏出率的影響

如圖7所示，H2O2模型組LDH釋放量顯著高于正常對照組(P<0.01)；姜黃素高、中劑量組LDH釋放量較H2O2模型組降低(P<0.05，P<0.01)。

圖5 姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of curcumin on cell cycle in H2O2-induced HT29 注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與 H2O2 組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01;compared with the H2O2 group,#P<0.05,##P<0.01.

圖6 姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞內ROS水平和線粒體膜電位的影響Fig.6 Effect of curcumin on the level of ROS and mitochondrial membrane potential in H2O2-induced HT29 注：與對照組比較，**P<0.01；與 H2O2 組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01;compared with the H2O2 group,#P<0.05,##P<0.01.

2.8 姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞內SOD，MDA水平和caspase-3，caspase-9酶活性的影響

與對照組比較， H2O2模型組中SOD顯著下降(P<0.01)，MDA顯著升高(P<0.01),caspase-3和caspase-9的活性均明顯增加(P<0.01)；與H2O2模型組相比，不同濃度姜黃素預處理組SOD明顯恢復(P<0.01)，MDA明顯被抑制(P<0.01)，caspase-3和caspase-9活性均顯著降低(P<0.01)，且在2.5～10 μmol/L濃度范圍呈劑量依賴關系(見圖8)。

3 討論

本實驗通過研究姜黃素對H2O2誘導HT29細胞氧化應激的影響，探討其作用的分子機制。首先通過H2O2誘導HT29細胞建立體外氧化應激模型。為了確定姜黃素對HT29細胞作用的無毒劑量范圍，通過MTT實驗，確定低中高三個劑量(2.5、5、10 μmol/L)的姜黃素進行后續的研究。姜黃素組能上調H2O2誘導的HT29細胞的存活率，降低細胞凋亡。 H2O2模型組阻滯細胞于G0/G1期；姜黃素組G0/G1期細胞明顯減少，S期細胞增加。提示該劑量范圍內的姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞氧化損傷的保護作用可能與抑制H2O2誘導的DNA損傷有關。

圖7 姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞內LDH漏出率的影響Fig.7 Effect of curcumin on the releasing rate of LDH in H2O2-induced HT29 注：與對照組比較，**P<0.01；與 H2O2 組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01；compared with the H2O2 group,#P<0.05,##P<0.01.

活性氧(ROS)是造成DNA氧化損傷的主要原因之一，也是機體內主要的氧化劑，正常生理條件下，SOD等體內的抗氧化劑能清除ROS，使ROS的產生和清除處于動態平衡狀態[12]。細胞受到損傷后，細胞內生成大量ROS，引發細胞膜上脂質過氧化反應，生成終產物MDA；MDA 可破壞組織細胞膜結構，導致受損的細胞膜通透性增強，LDH等胞內酶大量漏出[13]，LDH是細胞膜完整性的重要指標，細胞在氧化損傷過程中會將細胞內的LDH釋放到培養液中，所以培養液中LDH活性大小可反映細胞的死亡或損傷程度。本研究結果顯示，H2O2模型組ROS，LDH顯著升高，SOD活性降低，MDA活性提高，表明H2O2誘導細胞膜結構受損，造成抗氧化系統功能減弱，清除氧自由基能力下降；與H2O2模型組比較，姜黃素組ROS，LDH顯著降低， SOD活性明顯恢復，MDA活性明顯受到抑制，提示姜黃素具有明顯的抗氧化生物學活性，對H2O2導致的 HT29細胞氧化損傷的保護作用可能與清除ROS有關。

圖8 姜黃素對H2O2誘導的細胞內SOD，MDA水平和caspase-3，caspase-9酶活性的影響Fig.8 Effect of curcumin on the level of SOD,MDA,and the activities of caspase-3,caspase-9 注：與對照組比較，**P<0.01；與 H2O2 組比較， ##P<0.01。Note:Compared with the control group,**P<0.01;compared with the H2O2 group,##P<0.01.

線粒體是細胞的能量工廠，也是自由基最重要的來源， ROS可以通過多條途徑對線粒體造成損傷。本實驗中H2O2模型組線粒體膜電位較正常組顯著降低，姜黃素預處理組能顯著抑制 H2O2造成的線粒體膜電位的下降。表明2.5～10 μmol/L劑量范圍內的姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞氧化損傷的保護作用可能與線粒體途徑有關。

目前認為線粒體通路、死亡受體通路和內質網通路是細胞凋亡的三個主要凋亡信號通路， caspase-3是這些凋亡信號通路的執行者[14]。caspase-9是凋亡信號轉導過程中重要的上游 caspase。在線粒體通路中，活化的caspase-9可以激活caspase-3，引起細胞凋亡[15,16]。本研究通過對caspase-3和caspase-9酶活性進行檢測，發現姜黃素組能顯著下調 caspase-3和caspase-9 的活性，提示姜黃素對H2O2誘導的HT29細胞氧化損傷的保護作用可能與線粒體介導的凋亡途徑有關。

綜上所述，2.5～10 μmol/L劑量范圍的姜黃素對H2O2誘導的 HT29細胞氧化應激損傷具有較好的保護作用，其機制可能是通過抗氧化，改變細胞周期分布，減輕DNA氧化損傷，改善線粒體功能，下調誘導細胞凋亡的線粒體通路，從而發揮保護作用，修復H2O2誘導的氧化損傷。